Treg細胞及其效應因子Foxp3與反復自然流產相關性的Meta分析

趙心煜，徐 佳（新鄉醫學院三全學院檢驗與影像學院，河南新鄉450052）

反復自然流產（RSA）是指育齡女性連續2次或2次以上在妊娠28周以前、胎兒體重1 000 g以下時，胚胎自動停止發育而流產的現象[1]。RSA發病率隨著流產次數增加而增加，據統計，2次流產孕婦RSA發病率為5%，3次流產孕婦RSA發病率則可達到73%[2]。RSA病因復雜，與遺傳、感染，及免疫、生殖和內分泌系統異常等多種因素有關，其中免疫因素與RSA發病密切相關[3]。調節性T細胞（Treg細胞）主要是指具有免疫應答負調節作用的CD4+CD8+T細胞，在誘導免疫耐受及抑制自身免疫反應中具有重要作用[4]。部分RSA孕婦外周血Treg細胞數量明顯低于比非RSA孕婦，但也可能無差異。因此，本研究利用Meta分析的方法，通過檢索國內外RSA與Treg細胞及其效應因子相關性的病例-對照研究，加大研究樣本量，以減少因樣本量較小或研究水平、方法不同引起的偏倚，從而為RSA病因學研究及診療提供循證依據。

1 資料與方法

1.1 文獻的納入與排除標準

1.1.1 研究類型 涉及Treg細胞及其相關因子Foxp3與RSA相關性的病例-對照研究。

1.1.2 研究對象 （1）RSA組：連續發生2次或2次以上自然流產20～45歲中國女性患者（診斷標準：生殖器官無器質性病變，內分泌功能無異常，夫婦染色體顯帶核型分析正常，男方生育因素未見異常，排除感染因素，未接受相關治療）。（2）對照組包括正常早孕組和健康非孕組。正常早孕組：與RSA組同期隨機抽取的孕周3～12周健康妊娠女性，年齡與RSA組差異無統計學意義（P＞0.05），既往順利妊娠至少1胎，無自然流產史、死胎、死產史，無生殖系統解剖結構、內分泌、感染、遺傳等方面的異常，無自身免疫性疾病。此次妊娠過程中未出現腹痛、陰道流血等先兆流產癥狀與體征，超聲顯示胚胎發育正常。健康非孕組：與RSA組同期隨機抽取的為己婚、已生育女性，既往順利妊娠至少1胎，無自然流產史、死胎、死產史，月經周期規律，無生殖系統解剖結構、內分泌、感染、遺傳等方面的異常，無自身免疫性疾病。

1.1.3 研究指標 研究對象靜脈血Treg細胞數量、Foxp3表達水平。

表1 Treg細胞相關研究文獻基本特征

1.1.4 相似文獻處理 若出現相似研究報道（如研究對象、研究人員、研究時間、研究類型等相似），納入紐卡斯爾-渥太華量表（NOS量表）質量評分高、結局數據全面的研究。

1.1.5 排除標準 （1）重復報告的文獻；（2）不能獲取全文或信息量少的文獻；（3）綜述或論著類Meta研究文獻；（4）基礎研究類文獻，如細胞培養、動物實驗研究等；（5）重要數據報告不清或缺失的文獻；（6）NOS量表評分過低（＜5分）的文獻。

1.2 檢索策略 計算機聯合檢索CNKI、VIP、Wanfang Data、PubMed、Elsevier、EMbase、Web of Science 電子期刊數據庫，關于Treg細胞及Foxp3的病例-對照研究，始末時間為建刊至2016年10月。中文檢索式為：（1）（“Treg”或“CD4+CD25+調節性 T 細胞”）與（“反復自然流產”或“原因不明復發性流產”或“流產”）；（2）“Foxp3”與（“反復自然流產”或“原因不明復發性流產”或“流產”）。英文檢索式為：（1）（“regulatory T cells”or“Treg”）and（“RSA”or“URSA”or“recurrent spontaneous abortion”or“abortion”）；（2）（“forkhead box P3”or“forkhead/winged-helix family transcriptional repressor p3”or“Foxp3”）and（“RSA”or“URSA”or“recurrent spontaneous abortion”or“abortion”）。

1.3 文獻篩選、資料提取與質量評價 由2位研究者獨立進行文獻篩選，并使用設計好的表格提取資料，若遇分歧，則討論決定是否納入，若無法達成一致意見，則請第三者裁決。提取研究的基本資料包括：第一作者、發表雜志、發表時間、平均年齡、例數、研究結果、檢測方法。采用NOS量表對檢索到的文獻進行質量評價，評價內容包括病例選擇、基線可比性、暴露因素的測量，共8條，合計9分。

1.4 統計學處理 采用RevMan5.3統計軟件對數據進行分析。首先采用RevMan5.3軟件中的Q-檢驗（檢驗水準為α=0.1）對納入的文獻進行異質性分析，并用I2值評價異質性大小，若I2＜50%，表明異質性較小或異質性可忽略，采用固定效應模型進行分析；若I2＞50%，表明研究間具有較明顯異質性或異質性不能忽略，若各研究間有統計學異質性而無臨床異質性或無臨床意義，采用隨機效應模型進行分析。因本Meta分析的研究指標為連續型變量，故以均數差（MD）或標準均數差（SMD）及95%置信區間（95%CI）為效應指標。最后采用漏斗圖對納入的文獻進行風險偏倚檢驗（α=0.05）。

2 結 果

2.1 文獻檢索結果、納入研究的基本特征及質量評價 通過檢索策略檢索到中英文文獻共1 646篇，由2名工作人員嚴格按照文獻的納入和排除標準，經過初篩、精篩、終篩，最終納入24篇文獻，其中Treg細胞相關文獻15篇，Foxp3相關文獻9篇。納入研究的基本特征見表1～2。

表2 Foxp3相關研究文獻基本特征

2.2 Meta分析結果

2.2.1 RSA組與正常早孕組Treg細胞占CD4+T細胞百分比的比較 共納入11篇文獻[6-14，16-17]，RSA患者459例，正常早孕女性396例。各研究結果之間無統計學異質性（I2=77%，P＜0.05），故采用固定效應模型進行數據合并分析。因各研究間均值差異較大，所以采用SMD為效應值。結果顯示，RSA組與正常早孕組相比，Treg細胞占CD4+T細胞百分比明顯減低，差異具有統計學意義[SMD=-2.45，95%CI（-2.85，-2.04），P＜0.05]，見圖1。

2.2.2 RSA組和健康非孕組Treg細胞占CD4+T細胞百分比的比較 共納入 10 篇文獻[5，8-12，15，17-19]，RSA 患者384例，健康非孕女性325例。各研究結果之間具有統計學異質（I2=97%，P＜0.05），但因無臨床異質性，故采用隨機效應模型進行數據合并分析。各研究間均值差異較大，所以采用SMD為效應值。結果顯示，RSA組與健康非孕組相比，Treg細胞占CD4+T細胞百分比明顯減低，差異具有統計學意義[SMD=-2.45，95%CI（-3.65，-1.25），P＜0.05]，見圖2。

2.2.3 正常早孕組與健康非孕組Treg細胞占CD4+T細胞百分比的比較 共納入6篇文獻[8-12，17]，正常早孕女性269例，正常非孕女性257例。各研究結果之間具有統計學異質（I2=97%，P＜0.05），但因無臨床異質性，故采用隨機效應模型進行數據合并分析。各研究間均值差異較大，所以采用SMD為效應值。結果顯示，正常早孕組與健康非孕組相比，Treg細胞占CD4+T細胞百分比明顯升高，差異具有統計學意義[SMD=0.18，95%CI（-1.06，1.42），P＜0.05]，見圖3。

2.2.4 RSA組和正常早孕組Foxp3 mRNA表達水平分析 共納入 9 篇文獻[11，19，20-26]，RSA 患者 343 例，正常早孕女性355例。因檢測Foxp3 mRNA表達水平的方法包括RT-PCR和qRT-PCR，為避免方法學異質性影響結果的可靠性，故根據檢測方法的不同分為2個亞組（RT-PCR亞組和qRT-PCR亞組）進行Meta分析。亞組分析結果顯示，各研究結果之間仍具有明顯統計學異質性，但因無臨床異質性，故采用隨機效應模型進行數據合并分析。因各研究間均值差異較大，所以采用SMD為效應值。分析結果顯示，RSA組與正常早孕組相比，Foxp3 mRNA表達水平明顯減低，差異具有統計學意義[SMD=-5.52，95%CI（-7.38，-3.65），P＜0.05]，見圖4。

圖1 RSA組與正常早孕組Treg細胞占CD4+T細胞百分比Meta分析

圖2 RSA組與健康非孕組Treg細胞占CD4+T細胞百分比Meta分析

圖3 正常早孕組與健康非孕組Treg細胞占CD4+T細胞百分比Meta分析

圖4 RSA組和正常早孕組Foxp3 mRNA表達水平Meta分析

2.2.5 敏感性分析及發表偏倚 為保證結果穩定性，逐一剔除每個研究，再對剩下的研究進行Meta分析，檢測本研究結果的敏感性。結果顯示，剔除任何一項研究前后，效應值SMD未有明顯變化。采用漏斗圖對各研究指標進行發表偏倚檢驗，結果顯示，漏斗圖存在不對稱性，說明本研究納入的文獻可能存在發表偏倚，見圖5～8。

圖5 RSA組與正常早孕組Treg細胞占CD4+T細胞百分比漏斗圖

圖6 RSA組與健康非孕組Treg細胞占CD4+T細胞百分比漏斗圖

圖7 正常早孕組與健康非孕組Treg細胞占CD4+T細胞百分比漏斗圖

圖8 RSA組和正常早孕組Foxp3 mRNA表達分析的漏斗圖

3 討 論

Treg細胞是一種組成性表達的CD4+CD25+T細胞亞群，主要來源于胸腺，在機體中主要發揮免疫抑制作用。Treg細胞數量降低或功能缺陷可引起多種疾病，并且還參與了移植物免疫耐受。妊娠屬于一種半同種異體移植，妊娠成功與否取決于母胎之間雙向免疫調節的平衡，在這一平衡過程中Treg細胞發揮著至關重要的作用。大量研究表明，正常早孕女性外周血Treg細胞數量較健康非孕女性增高[8-12]，RSA妊娠女性外周血Treg細胞數量明顯低于正常早孕女性和健康非孕女性[5-11]，但章雪蓮等[12]研究顯示，RSA妊娠女性外周血Treg細胞數量與正常早孕女性相比無明顯差異（P＞0.05）。因此，RSA妊娠女性外周血Treg細胞數量變化尚缺乏共識。本研究綜合多項研究結果，通過加大樣本量，減少小樣本量對結果的影響，Meta分析結果顯示，RSA妊娠女性外周血Treg細胞數量明顯低于正常早孕女性和健康非孕女性，正常早孕女性外周血Treg細胞數量明顯高于健康非孕女性，進一步證實RSA與Treg細胞數量降低有關，正常妊娠需具備足夠數量的Treg細胞。

Foxp3是Treg細胞特異性轉錄因子，可使外周血CD4+CD25-幼稚細胞向CD4+CD25+Treg細胞轉變，對Treg細胞發育和功能維持具有重要作用[17]。本次Meta分析結果顯示，RSA妊娠女性外周血Foxp3表達水平明顯低于正常早孕女性，提示RSA與Foxp3表達下降有關。結合Treg細胞數量變化特征，可以認為RSA患者外周血Treg細胞數量和功能均發生異常，也正因Treg細胞的異常，導致母體對胎兒的免疫耐受為降低、免疫排斥反應增強，進而引起病理妊娠。

文獻異質性分析結果顯示，健康非孕組與RSA組、健康早孕組Treg細胞占CD4+T細胞比例比較，其異質性均明顯高于RSA組與健康早孕組比較結果，提示在建立Treg細胞占CD4+T細胞百分比診斷RSA參考值時，應以正常早孕者檢測結果為基礎建立參考值范圍，而且兩類人群均具有相同的妊娠機體環境，更具可比性。納入的各文獻中，Foxp3 mRNA表達水平具有較大差異，提示此兩項指標的水平可能不穩定，調節機制復雜，而在臨床檢測中應統一方法和標準，并擴大樣本量，建立更適合的參考值。

雖然本研究為避免選擇性偏倚，進行了方法學評估，異質性分析結果顯示各文獻間仍存在異質性，這可能導致各研究結果不具可比性。但因各文獻間不存在臨床異質性，所以采用了隨機效應模型對同類研究SMD值進行了合并，對文獻異質性進行了控制，保證了結果可靠性。敏感性分析結果顯示，逐一剔除各研究，效應值SMD未有明顯變化，說明本研究結果穩定性好。但偏倚分析結果表明，各研究間存在發表偏倚，說明現有的研究質量還有待提高，這是本研究的主要局限因素。本研究是國內第一篇關于Treg細胞及其相關因子Foxp3與RSA相關性的Meta分析論文，采用統計學方法將多項研究結果合并分析，保證了結果客觀性，并且所有的研究都按照嚴格的納入和排除標準篩選，所以本研究結果與實際研究結果較為接近。

綜上所述，Treg細胞數量及其相關因子Foxp3表達水平降低與RSA的發生密切相關。已有關于自身免疫性疾病和腫瘤領域Treg免疫治療的研究報道，若進一步深入研究Treg細胞與RSA發病機制的相關性，可為Treg細胞應用于妊娠免疫治療提供依據。但在今后的研究中需加大樣本量，提高檢測方法的精確度，進行高質量的病例-對照研究。