2016-2017年江蘇泰州地區單核細胞增生性李斯特菌流行現狀監測

顏 衛,丁立軍,盧勁曄,沈曉鵬,周媛麗

（江蘇農牧科技職業學院 ,江蘇 泰州 225300）

單核細胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes,L.monocytogenes）是一種兼性胞內寄生菌,可引起人和多種家畜家禽的李斯特菌病。該病發病率低,致死率達到20% ～30%。易感人群主要為孕婦、新生兒、老年人、免疫力低下人群,會出現流產、腦膜炎、敗血癥及多器官功能障礙等。動物李斯特菌病以中樞神經系統感染為主,初期有精神沉郁、食欲不振、發熱等癥狀,幾天后會出現腦膜炎癥狀。動物的發病主要與食用污染的飼料有關,病原菌經過污染農場、食品加工、銷售傳染給人。李斯特菌病在歐美國家曾多次暴發流行,我國也有L.monocy togenes在畜禽和人之間暴發的報道[1]。作為四大食源性病原菌之一,從食物、人群、動物3個維度對產單核細胞李斯特菌的流行現狀進行監測,及時的風險預警具有重要的公共衛生學意義。

1 材料與方法

1.1 培養基與試劑 李斯特增菌培養基,購自BD公司;李斯特選擇培養基OXFORD、純培養基BHI,均購自 OXOID 公司;Buffer、dNTPs、Taq酶、低分子量DNA Marker,購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 樣品來源 2016年8月-2017年7月在江蘇泰州地區采集醫院病人腦脊液樣品、豬場和羊場動物樣品、超市、農貿市場、餐飲店食品樣品共946份進行單核細胞增生性李斯特菌的檢測。棉拭樣品用Cary-Blair運送培養基,其余樣品置于4℃冰盒6 h內送達實驗室檢測。

1.3 L.monocytogenes的分離 Carry-Blair培養基中取出的棉拭樣本、食品類固體樣本1 g剪碎、液體樣本1 mL,加入9 mL增菌培養基LEB中培養24 h,挑取增菌液劃線接種于選擇培養基OXFORD上培養24 h,選擇疑似菌落（細小、濕潤、黑色）接種純培養基BHI,過夜培養,菌液用溶菌酶-蛋白酶K法提取基因組DNA,具體步驟為:250 μL菌液13 000 r/min離心10 min,上清液棄去,菌體用95 μL Buffer混勻后加入4 μL溶菌酶（50 mg/mL）孵育15 min,再加入1 μL蛋白酶K（20 mg/mL）稍許震蕩后58℃孵育至菌液澄清,95℃加熱8 min后離心取上清液進行PCR檢測。

1.4 L.monocytogenes的鑒定 參照周曉輝的方法[2],以L.monocytogenes的毒力基因溶血素基因hly下游片段設計引物,PCR體系中各成分的量為:10 × Buffer 2.5 μL,MgCl21.5 μL,dNTPs 5 pmol/L,hly引物各 10 pmol/L,模板 DNA 3 μL,Taq酶0.2 μL,去離子水14.8 μL。 PCR 反應程序為:94 ℃2 min,95℃10 s,60℃30 s,72℃30 s,35個循環,72℃ 10 min。取8 μL PCR產物點樣進行瓊脂糖凝膠電泳,成像儀上觀察結果,在850 bp處出現特異性條帶的為單核細胞增生性李斯特菌陽性。

2 結果與分析

2.1 腦脊液樣本L.monocytogenes的監測結果 從醫院患者的腦脊液樣本24份中未分離到L.monocytogenes。

2.2 動物源樣本L.monocytogenes的監測結果 從動物養殖場采集樣本263份,分離到L.monocytogenes 4株,陽性率1.52%。豬場健康豬鼻腔棉拭樣本、肛拭樣本87份,陽性樣本1份,L.monocytogenes污染率1.15%;豬場環境樣本61份,分離到 L.monocytogenes 1株,陽性率1.64%;羊場健康羊鼻腔棉拭樣本、肛拭樣本73份,陽性樣本1份,L.monocytogenes污染率1.37%;羊場環境樣本42份,分離到L.monocytogenes 1株,陽性率2.38%。

2.3 食源樣本L.monocytogenes的監測結果 從農貿市場、超市和包括鹵菜店、飲品店在內的餐飲店采集食物樣本659份,分離到L.monocytogenes 26株,陽性率為3.95%。其中肉制品為采集自市場和超市的豬肉、牛肉、雞肉,共137份,L.monocytogenes檢出率12.41%;水產品樣本包括來源于市場、超市的淡水魚、蝦、海水魚177份,L.monocytogenes檢出率2.26%;冷凍魚糜制品包括火鍋、麻辣燙食品中經常食用的魚丸、蝦丸、蟹肉棒58份,采集自超市,檢出率1.72%;采集自鹵菜店的熟肉制品包括消費者經常購買的豬肉、豬舌頭、豬耳朵、鵝肉、雞肉 51份,L.monocytogenes檢出率3.92%;涼拌菜52份,分離率1.92%;通過現場、電話、網絡訂餐方式采集的外賣盒飯樣品44份,分離到1株 L.monocytogenes,陽性率2.27%;蔬菜、乳制品、果汁中未檢測到L.monocytogenes,具體數據如表1。

表1 不同食物樣品L.monocytogenes監測結果

依據采樣地點不同,659份食物樣品分別來源于農貿市場、超市和餐飲服務場所,包括針對不同消費群體的鹵菜店、飲品店、快餐小吃店、餐館等,L.monocytogenes檢出率如表2,檢出率最高的為市場樣品,236樣品中分離到L.monocytogenes15株,陽性率6.36%;其次為超市樣品,240份中陽性樣品7份,陽性率2.92%;183份餐飲樣品分離到L.monocytogenes4株,陽性率2.19%。

表2 不同采樣地點L.monocytogenes檢出情況

采集的10類食品分為即食食品和非即食食品兩大類,其中即食食品包括熟肉制品、涼拌菜、乳制品、果汁、外賣盒飯5類;非即食食品包括生畜禽肉、淡水魚蝦、海魚、冷凍魚糜、蔬菜5類。表3結果顯示221份即食食品中L.monocytogenes檢出率為1.81%,438份非即食食品中L.monocytogenes檢出率為5.02%,非即食食品的L.monocytogenes檢出率高于即食食品。

表3 即食食品和非即食食品L.monocytogenes檢出情況

不同季度樣品的監測結果見表4,4個季度均有L.monocytogenes陽性樣品檢出,檢出率依次為2.42% 、3.62% 、5.05% 、3.91% 。

表4 不同季度樣品中L.monocytogenes檢出情況

3 討論

本試驗腦脊液樣本未分離到L.monocytogenes,這與樣品采集范圍不廣,樣品量不夠大有關,此外,目前國內人群李斯特菌病多為散發,免疫功能低下者多表現為中樞感染,孕婦多見局灶感染,且感染的原因多為食源性的,可通過胎盤、產道感染胎兒,引起新生兒化膿性腦膜炎、敗血癥等。健康人群感染L.monocytogenes后,病原菌主要在肝細胞增殖,最終被T淋巴細胞介導的免疫應答清除[3]。感染的確診有賴于血液、腦脊液等的微生物學檢測,早期選擇有效的抗生素,如氨芐西林或大劑量青霉素[4],也可選用萬古霉素、碳青霉烯類等可以改善預后,降低死亡率。

L.monocytogenes在自然界廣泛存在,多種動物均可感染,其中豬感染病例報道較多,其次為羊。本研究在健康豬群、羊群、環境中均分離到L.monocytogenes,雖然未發生動物疫情,但環境中的致病菌對動物群仍構成威脅,是引起疫病的隱患。動物李斯特菌病的發生主要與食用污染的貯存飼料有關,霉變、低酸度劣質青貯是L.monocytogenes的主要貯存場所,往往會引發羊群暴發李斯特菌病。試驗中采樣的養殖場飼料質量過關,羊群飼喂干草。提高飼料質量,減少動物群密度,保障動物一定量的運動,同時按操作規程加強養殖場環境管理,定期消毒是保證動物群健康的有效措施。

食源樣本中L.monocytogenes污染率為3.95%,10類食品中生畜禽肉的陽性率最高,達到12.41%,說明在畜禽屠宰、加工、銷售環節還需要進一步加強監管。首先從宰前飼養環境抓起,環境的定期消毒非常重要。生產過程中畜禽胴體產品和腸道產品可采取分開處理的方式,控制內臟沖洗對胴體和環境的污染,肉品保存的冷庫環境也不容忽視,與其他食源性人獸共患病原菌不同,L.monocytogenes對生存溫度要求廣泛,低溫下仍生長良好,這一特性提示了冷庫肉品也有被污染的可能。流通環節的自然環境、污水、切割器具、接觸器皿、被污染的其他生熟食品都是造成或加重肉制品污染L.monocytogenes的原因。水產品中淡水魚蝦污染率1.90%、海魚污染率2.78%,可能是由于冷藏運輸過程中L.monocytogenes增殖或發生二次污染。冷凍魚糜制品（魚丸、蝦丸、蟹肉棒等）污染率1.72%的原因有3個方面:（1）原料即水產品的污染;（2）加工過程的污染,經過切割、絞碎、攪拌等步驟,設備、人員、環境會造成交叉污染,運輸、銷售過程也會受到人員污染;（3）存貯溫度不達標,存在敞口銷售、反復凍融等現象,未按照標準全程冷鏈。即食食品的污染率1.81%,提示在食品加工過程中要嚴格按照規范進行操作,生熟食分開,同時生熟食的加工用具也要分開。目前,全國范圍內餐飲即食食品的微生物標準正在制定,江蘇已經建立了相關的地方標準[5]。試驗監測到熟肉制品L.monocytogenes污染率達到3.92%,熟肉制品的銷售過程基本開放,銷售時間較長,有的鹵菜攤點不防塵、無消毒、無冷藏,這些都會造成食物的二次污染,引起致病菌的增殖。從外賣盒飯中分離到L.monocytogenes說明餐飲店還需要從原料監管、設施管理、人員培訓、衛生安全意識強化等方面著手進一步提高食品安全管理水平,同時需要加強對網絡訂餐平臺的運營監管。不同采樣地點的檢出情況比較顯示,市場檢出率最高6.36%,這與衛生條件、儲藏條件相對較差、人口密集有關,需要加大對市場的監管力度,提高個體經營者的食品衛生安全意識,定期進行衛生知識培訓。