馬齒莧水提液對DSS誘導結腸炎大鼠的保護作用

卞藝斐,胡士玲,劉 萍,范 開,王帥玉,劉鐘杰

（中國農業大學動物醫學院,北京 海淀 100193）

馬齒莧（Portulaca oleracea.L.）又名馬齒菜、螞蟻菜、長壽菜、五行草等,系馬齒莧科馬齒莧屬植物,是一種藥食同源植物,首載于《新修本草》。《本草綱目》記載:“其葉并比如馬齒,而性滑利似莧,故名”。馬齒莧性寒、味酸、無毒,入心、肝、脾、大腸經,具有清熱解毒、散血消腫、涼血止血、止痢、止消渴等功效,可用于治療熱痢膿血、熱淋、帶下、便血、瘡瘍腫毒、濕疹等多種疾病[1]。

炎性腸病（IBD）,包括克羅恩病（CD）和潰瘍性結腸炎（UC）,是一種慢性、免疫性腸病,以長期性腹瀉、血便、反復性發作為主要臨床癥狀[2]。DSS因帶有負電荷的硫酸基而對上皮細胞有一定毒性,誘導其糜爛而損害結腸屏障完整性和增加結腸上皮滲透性,破壞腸黏膜屏障,導致腸道細菌入侵,引起炎癥反應。DSS誘導性結腸炎發病部位主要在結腸遠端,其病理表現符合潰瘍性結腸炎的特點,是較理想的研究模型[3]。

由于日糧配比不合理、過量食用高油高熱量食物、運動量不足等原因,寵物臨床上炎性腸病的發病率日益升高,嚴重影響寵物及寵物主人的生活質量。目前的治療方法多依賴于免疫抑制類藥物,如糖皮質激素及5-羥基水楊酸（5-ASA）,這些治療方法存在副作用明顯、治愈率低等問題[4]。迫切需要尋找高效、副作用小的抗炎藥物治療炎性腸病。馬齒莧常用于治療熱毒血痢,療效顯著,本次試驗旨在驗證馬齒莧水提液對試驗性結腸炎的治療作用,并探究其機理。

1 材料

1.1 實驗動物 體重180 g±7 g的雌性 SD大鼠30只,購自北京軍事科學院實驗動物中心。

1.2 主要試劑 馬齒莧:購自北京同仁堂馬連洼分店,低分子量硫酸葡聚糖鈉（DSS）:美國 Sigma公司;MPO試劑盒:北京華佰泰生物科技公司;TNF-α、IL-1 ELISA試劑盒:美國R&D公司。

1.3 主要儀器 scout SE602F便攜式電子天平:美國OHAUS公司;陶瓷全自動保健壺CK-30C:佛山市飛鹿電器有限公司;旋轉蒸發儀RE-64A:上海亞榮生化儀器廠;SHZ-Ⅲ型循環水真空泵:上海亞榮生化儀器廠。

2 方法

2.1 馬齒莧水提液制備 電子天平稱取100 g馬齒莧,加入1 L蒸餾水,充分浸泡30 min后,先大火煮沸,再調至小火,30 min后停火,室溫冷卻后將藥液用16層脫脂細紗布過濾至大燒杯中,然后用雙層分析濾紙加壓過濾,最后收集藥液用旋轉蒸發儀減壓濃縮至原藥生藥濃度為1 g/mL。

2.2 動物分組與給藥 將30只大鼠隨機分為空白對照組、DSS模型組、高濃度藥物組、中濃度藥物組、低濃度藥物組5組,每組6只。空白對照組:大鼠自由飲用蒸餾水,每日蒸餾水灌胃。模型組:大鼠自由飲用5%DSS溶液,每日蒸餾水灌胃。高劑量藥物組:大鼠自由飲用5%DSS溶液,每日給予10 g/kg·bw馬齒莧。中劑量藥物組:大鼠自由飲用5%DSS溶液,每日給予7.5 g/kg·bw馬齒莧。低劑量藥物組:大鼠自由飲用5%DSS溶液,每日給予5 g/kg·bw馬齒莧。

2.3指標檢測

2.3.1大鼠結腸炎疾病活動指數（the disease activity index,DAI）評分 參考文獻方法[5]進行DAI評分。DAI由體重減失率分數、大便狀態和大便隱血分數相加而得。評分標準:體重減失評分:體重無減輕,0分;減輕1% ～5%,1分;減輕5% ～10%,2分;減輕10% ～15%,3分;減輕15%以上,4分。大便狀態評分:正常顆粒狀,0分;稍松軟,1分;中度松軟,2分;不成形,3分;水樣糞便,4分。糞便隱血評分:隱血陰性,0分;隱血弱陽性,1分;隱血陽性,2分;隱血強陽性,3分;肉眼可見血便,4分。

2.3.2 結腸組織長/重比 各組大鼠處死后,取大鼠整段結腸。生理鹽水洗凈腸內容物后,吸水紙吸取表面液體,稱重并測量長度。

2.3.3 髓過氧化物（MPO）測定 取近段結腸1 cm,迅速放入液氮中冷凍保存。測定時加入9倍于組織重量的PBS制成10%組織勻漿,按照MPO試劑盒說明書進行操作。

2.3.4 組織炎性因子測定 組織勻漿制備方法同2.3.3,TNF-α和IL-1濃度分別按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

2.3.5 統計學處理 數據采用SPSS 17.0軟件進行統計,數據均用平均數±標準差表示,組間比較采用t檢驗。P≤0.05認為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 造模后各組動物一般情況 給予DSS飲用3 d,造模組、高、中、低藥物組動物均出現稀便、精神沉郁、豎毛等情況。至DSS飲用第5天,造模組大鼠出現血便,體重明顯減輕,而各藥物組與造模組相比狀態有明顯改善,精神狀態較好,活動靈活。高、中濃度藥物組糞便狀態與空白對照組相似。

3.2 大鼠DAI評分 如圖1所示,造模組均出現比較嚴重的體重減輕、水樣腹瀉甚至血便,DAI評分較空白對照組顯著升高;飼喂高、中、低劑量馬齒莧組均能顯著改善大鼠的癥狀,DAI均顯著降低。

3.3 大鼠結腸組織腸長/腸重 如圖2所示,造模組腸長/腸重比值與空白對照組相比顯著降低,高劑量、中劑量馬齒莧組的腸長/腸重比與造模組相比有較顯著升高,低劑量馬齒莧組與造模組相比沒有顯著差異。

3.4 大鼠結腸組織MPO活性 DSS造模組結腸組織中MPO活性較正常組顯著增加,不同濃度馬齒莧水提液均能顯著抑制結腸組織MPO活性,中劑量組效果更好。

圖1 不同濃度馬齒莧對DSS誘導的結腸炎大鼠DAI

圖2 不同濃度馬齒莧對DSS誘導的的結腸炎大鼠結腸組織腸長/腸重

圖3 不同濃度馬齒莧對DSS誘導的結腸炎大鼠DAI

3.5 大鼠結腸組織炎性因子 DSS造模組結腸組織中TNF-α和IL-1的表達顯著增高,不同濃度馬齒莧水提液均能顯著抑制結腸組織TNF-α和IL-1分泌。

4 討論

炎性腸病為腸黏膜免疫保護效應和調節效應失衡所導致的腸黏膜性疾病。中獸醫上認為炎癥性腸病發生的關鍵是濕熱內蘊,氣血壅滯。目前常用的化學誘導動物模型主要有TNBS和DSS誘導的試驗性腸炎。本試驗中造模組明顯出現體重減輕、腹瀉、便血的癥狀,說明DSS造模成功。在試驗第3天,藥物治療組與造模組大鼠均出現明顯的腹瀉反應,DSS飼喂第5天時,造模組大鼠狀態持續惡化,治療組出現好轉,而到DSS飼喂第7天,造模組大鼠出現血便、精神萎靡、體重嚴重減輕等癥狀,藥物治療組各方面均明顯好于造模組,DAI指數顯著降低。MPO是嗜中性粒細胞的特征性酶,組織中的MPO活性代表了嗜中性粒細胞的浸潤程度,與炎癥密切相關[6]。DSS造模組結腸組織中MPO顯著增強,而不同濃度藥物組均顯著抑制MPO活性。結腸組織腸長/腸重比值減小也是結腸炎炎性浸潤的一項重要指標[7]。DSS造模組大鼠腸長/腸重比值與空白對照組相比較顯著降低,而高劑量、中劑量馬齒莧組均有顯著升高。說明馬齒莧水提液可以顯著抑制結腸組織的炎性反應。TNF-α是最主要的內源性促炎介質;IL-1介導局部和全身的炎癥反應,TNF-α和IL-1在炎性腸病進程中發揮著重要的作用,抑制TNF-α和IL-1的表達是治療炎性腸病的一個重要方面[8]。本試驗中,造模組腸組織勻漿中TNF-α和IL-1濃度均顯著增高5倍以上,馬齒莧治療組的TNF-α和IL-1濃度均有明顯降低,說明馬齒莧水提液具有抑制試驗性結腸炎炎性因子分泌的功效。綜上,馬齒莧水提液抑制結腸炎性因子分泌和組織炎性反應,對DSS誘導的試驗性結腸炎大鼠有明顯的保護作用。

圖4 不同濃度馬齒莧對DSS誘導的結腸炎大鼠結腸組織炎性因子濃度

馬齒莧性味酸寒,臨床上多用于治療熱毒血痢。體外抗菌試驗表明,馬齒莧醇提物對多種細菌、真菌有很強的抗菌能力,被譽為“天然抗生素”[9]。馬齒莧水提液能有效抑制LPS誘導的小鼠巨噬細胞分泌炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌[10]。馬齒莧對病毒誘導的炎性反應內皮細胞損傷也有良好的保護作用[11]。馬齒莧含有豐富的有機酸類、黃酮類、萜類及生物堿類物質,其中有機酸中含量最多的ω-3脂肪酸和黃酮類含量最多的槲皮素、山奈酚均被證明有良好的抗炎作用[12]。馬齒莧抗炎的有效成分及分子機理有待進一步研究。