牛可食性組織中加米霉素殘留量的液相色譜-串聯質譜檢測方法的研究

王艷艷,王紅霄,鄧 菲

（華北制藥集團動物保健品有限責任公司,河北 石家莊 050041）

加米霉素（Gamithromycin）,是一種新型的半合成大環內酯類動物專用抗生素[1],通過與敏感菌核糖體的50S亞基不可逆的結合,使肽酰tRNA解離進而阻斷肽鏈的合成進而影響蛋白質的合成,最終達到抑菌和殺菌的作用。該藥由法國梅里亞有限公司研制,其商品名為Zactran（規格:150 mg/mL）,2007年9月經歐盟批準用于靶動物牛[1],2016年2月經歐盟批準用于靶動物豬[2]。在國外已被用于預防和治療非泌乳牛和豬的呼吸系統疾病[1-2],并取得了良好的效果。作為第二代大環內酯類抗生素的代表藥物之一,其具有抗菌譜廣、抗菌活性強、動物專用、單次給藥、吸收迅速、生物利用度高、低殘留、安全高效等優點,在畜禽養殖生產中具有非常廣闊的應用前景。

目前,動物源性食品中加米霉素殘留量的檢測方法有高效液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法等。高效液相色譜法因其重復性較好、成本低、定量準確以及受樣品基質影響小等優點,在一段時間內被用于加米霉素的定量檢測[3]。但由于加米霉素紫外吸收弱且吸收波長（215 nm）與流動相中的甲醇（190 nm）、乙腈（205 nm）相近,從而限制了高效液相色譜法的應用。液相色譜-質譜法（LCMS）和液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）為加米霉素的檢測提供了更加靈敏、可靠、快捷的手段[4]。本文建立了其在牛可食性組織中殘留量的UPLCMS/MS方法。

1 試劑與材料

1.1 試劑 加米霉素（Trc公司;純度為95%）;加米霉素-d5（內標）（Trc公司;純度為95%）;超純水（Milli-Q超純水儀制取）;乙腈、甲醇均為色譜純（Merck公司）;甲酸、正己烷、磷酸二氫鉀、氨水均為國產分析純;Oasis HLB固相萃取柱（Waters公司;60 mg）; 濾膜（Pall公司,0.2 μm）;硅藻土（Sigma公司,CeliteR545）。

1.2 試劑的配制 0.1mol/L磷酸二氫鉀緩沖液:稱取磷酸二氫鉀13.60 g,溶于1 000 mL水中。

5%氨化乙腈-甲醇（7∶3,v/v）:取氨水5 mL,用乙腈 -甲醇（7∶3,v/v）稀釋100 mL。

加米霉素標準儲備液（1 mg/mL）:準確稱取加米霉素標準品適量,于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,配成濃度為1 mg/mL的標準儲備液。 -20℃貯藏,有效期6個月。

加米霉素-d5內標儲備液（100 μg/mL）:準確稱取加米霉素-d5標準品適量,于5 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,配成濃度為100 μg/mL的標準儲備液。 -20℃貯藏,有效期6個月。

加米霉素標準工作液（10 μg/mL）:取 0.5 mL加米霉素標準儲備液于50 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度。 -20℃貯藏,有效期6個月。

加米霉素 -d5內標工作液（1 μg/mL）:取0.1 mL加米霉素-d5內標儲備液于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度。-20℃貯藏,有效期6個月。

2 儀器和設備

高效液相色譜儀-串聯質譜儀（Agilent Technologies 6430）;高速冷凍離心機（Sigma公司）;氮吹儀（美國Organomation公司）;旋渦混合器（IKA公司）。

3 測定方法[4-10]

3.1 樣品提取凈化 取1 g動物組織,加入適量的標準溶液和內標溶液,渦動15 s,靜置15 min,加入10 mL 0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液渦動1 min,9 000 r/min離心10 min,收集上清,殘渣用10 mL磷酸二氫鉀緩沖液重復提取一次;合并上清液,備用。

采用HLB固相萃取柱進行凈化。預先在HLB小柱上方加入0.2 g硅藻土,依次用3 mL甲醇、3 mL水進行活化,取備用液10 mL上柱,并確保溶液緩慢流過HLB柱（必要時可采用真空泵）。然后用3 mL 5%氨水、3 mL甲醇∶水（70∶30,v/v）進行洗滌。 用3 mL乙腈∶甲醇（70∶30,v/v,含5%氨水）溶液洗脫。 洗脫液于40℃水浴氮氣下吹干。用1 mL甲醇∶水（50∶50,v/v）溶液復溶,渦動1 min;加入3 mL正己烷渦動1 min,10 000 r/min離心5 min,棄正己烷,過0.2 μm濾膜,供高效液相色譜-串聯質譜法測定。

3.2 標準曲線的測定 在空白的牛組織基質匹配液中,添加不同量的加米霉素,繪制加米霉素的標準曲線。 配制成加米霉素濃度為 5、10、20、100、250、500 μg/L,而加米霉素 -d5 濃度為 100 μg/L的系列基質匹配標準工作液,供液相色譜-串聯質譜法測定。以測得的加米霉素及內標的定量離子質量色譜峰面積之比為縱坐標,對應的加米霉素濃度為橫坐標,繪制標準曲線。求回歸方程和相關系數。

3.3 空白組織添加樣品的制備 在1 g空白的牛組織中添加不同量的加米霉素及相同量的加米霉素-d5。工作溶液制備空白添加樣品,對應每個組織中的加米霉素的4個濃度。每種組織每個濃度3個批次,每個批次6個平行。這些樣品用于檢查分析方法的靈敏度、分析物的保留時間及評價相對回收率和變異系數。見表1

表1 牛空白組織中加米霉素添加樣品的制備

3.4 色譜條件 色譜柱:Luna C18,2.1×50 mm,5 μm;流動相:A相為0.1%甲酸水溶液;B相為0.1%甲酸乙腈溶液;流速:0.25 mL/min;柱溫:30 ℃ ;進樣量:5 μL。

梯度洗脫:梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫條件

3.5 質譜條件 離子源:電噴霧離子源;掃描方式:正離子掃描;檢測方式:多反應監測;電離電壓:3.0 kV;霧化溫度:350℃;霧化氣流速:540 L/h。

測試藥物定性、定量離子對及對應的裂解電壓、碰撞能量見表3。

表3 加米霉素的定性、定量離子及裂解電壓、碰撞能量

3.6 定量測定 取試樣溶液和相應的基質匹配標準工作液,按內標法定量,標準工作液及試樣溶液中的加米霉素的響應值均應在儀器檢測的線性范圍內。方法學驗證時的添加回收樣品,采用單點校正的方式定量。

3.7 計算 標準曲線的擬合采用最小線性二乘法,準確度和精密度的計算采用單點校正法。

4 結果

4.1 標準曲線 各組織標準曲線回歸方程和相關系數,見表4。

表4 標準曲線線性驗證結果

4.2 靈敏度 在空白組織中添加不同濃度的加米霉素,測定信噪比（S/N）≥3時為檢測限,S/N≥10時為定量限。本方法對于牛肌肉、肝臟、腎臟和脂肪添加濃度為1μg/kg時其信噪比（S/N）分別為:9.1、8.3、14.1、22.3;本方法對于牛肌肉、肝臟、腎臟和脂肪添加濃度為2 μg/kg時其信噪比（S/N）分別 為:28.4、31.5、36.9、38.2,平 均 回 收 率93.56%～103.89%,批內變異系數1.82%～8.68%,批間變異系數2.79% ～6.70%,故定量限均可設定為 2 μg/kg。

4.3 準確度和精密度 取表1制備的空白添加樣品,按上述方法處理、測定后,計算組織樣品中加米霉素的回收率和變異系數。組織樣品的回收率結果見表5、表6,變異系數結果見表7、表8。

表5 牛肌肉和豬肝臟中加米霉素的回收率/%

表6 牛腎臟和牛脂肪中加米霉素的回收率/%

表7 牛肌肉和牛肝臟中加米霉素的變異系數/%

表8 牛腎臟和牛脂肪中加米霉素的變異系數/%

5 結論

本試驗建立了一種快速、可靠的“牛組織中加米霉素殘留量測定-高效液相色譜串聯質譜法”,在牛肌肉、肝臟、腎臟、脂肪中的加米霉素的檢測限均可設定為1 μg/kg,定量限均可設定為2 μg/kg,基質匹配標準曲線范圍為 5 μg/L～500 μg/L,相關系數 ＞0.99;牛肌肉和腎臟組織在2、50、100、200 μg/kg 四個添加濃度的平均回收率為93.56% ～103.31%,批內變異系數≤8.67%,批間變異系數≤6.70%;牛肝臟組織在2、100、200、400 μg/kg 四個添加濃度的平均回收率為94.37% ～102.52%,批內變異系數≤5.70%,批間變異系數≤4.61%;牛脂肪組織在2、10、20、40 μg/kg四個添加濃度的平均回收率為100.95% ～105.58%,批內變異系數≤5.89%,批間變異系數≤4.52%;該方法樣品處理方法簡便、靈敏度高,適用于牛可食性組織中加米霉素的殘留監測。