北京地區鴨源大腸桿菌耐藥表型和Tet aac耐藥基因的檢測

劉硯涵,陳詩佳音,馮獻程,夏兆飛

（中國農業大學動物醫學院,北京 海淀 100193）

大腸桿菌是導致肉鴨細菌性疾病的重要細菌之一,其發病率呈上升趨勢。由于大腸桿菌的血清型眾多,極易形成耐藥性,再加上養殖戶對抗生素的濫用,導致鴨源大腸桿菌的耐藥譜不斷擴大。與此同時,鴨源大腸桿菌的耐藥性會造成抗生素療效欠佳,嚴重影響了肉鴨疾病的治療以及公共衛生。然而,國內僅有幾篇對肉鴨源大腸桿菌耐藥基因檢測的文獻報道,北京地區的肉鴨源耐藥基因資料更是缺乏。根據文獻,攜帶耐藥基因是細菌產生耐藥性的重要原因,造成對氨基糖苷類藥物耐藥性的主要是編碼氨基糖苷類鈍化酶的基因,以aac基因最為常見;造成對四環素藥物耐藥性的主要是編碼四環素外排泵的基因,即Tet基因[1-2]。由于文獻報道大腸桿菌對四環素耐藥嚴重,而氨基糖苷類藥物是筆者采集樣本的養殖場常用的抗生素,因此本研究選取了5種Tet基因和2種aac基因進行檢測,并對Tet和aac兩類耐藥基因的攜帶情況與耐藥表型之間的關系進行分析,以期為指導養殖戶合理使用抗生素和臨床耐藥性監測提供依據,并為進一步研究耐藥性的傳播機制奠定基礎。

1 材料

1.1 主要材料 巧克力培養基、麥康凱瓊脂培養基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養基、普通營養瓊脂培養基及MH瓊脂培養基,購自北京智博鼎盛生物技術有限責任公司;藥敏紙片,均購自杭州天和微生物試劑有限公司;EasyPure Genomic DNA Kit、Trans 2K DNA Marker、2 ×Easy Taq PCR Super Mix,購自北京全式金生物技術有限公司;16S rDNA通用引物以及耐藥基因引物由北京奧美德諾生物技術公司合成。質控菌為大腸桿菌標準株（ATCC 25922）。

1.2 樣品來源 病料來自北京市大興區、順義區和延慶區的16個鴨場,共53份病料。

2 方法

2.1 分離培養 無菌環境下取病死鴨的肝臟,帶回實驗室,分別劃線接種于麥康凱瓊脂培養基、LB瓊脂和三糖鐵瓊脂斜面培養,37℃培養18～24 h,觀察細菌生長情況及菌落特征。

2.2 細菌純化 取初步分離的單菌落,劃線于麥康凱瓊脂培養基和伊紅美藍培養基上,37℃培養24 h。

2.3 細菌形態學觀察 取用接種環勾取純化的菌株,單菌落涂片,革蘭染色、鏡檢。

2.4 分離菌16S rRNA分子和耐藥基因的鑒定取純化培養的細菌懸液,用EasyPure Genomic DNA Kit提取基因組DNA作為PCR模板;采用通用引物擴增細菌的16S rRNA,預期大小約為1 500 bp;PCR 擴增體系（40 μL）:2 × EasyTaq PCR Super Mix 20 μL,ddH2O 14 μL,上、下游引物各 2 μL,DNA 模版2 μL;PCR程序:95℃,10 min,95℃,30 s,56℃,30 s,72℃,1 min,32個循環;72℃,8 min[3]。擴增產物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統觀察并記錄結果。

用表1所示的引物對分離菌株進行耐藥基因檢測。 PCR 擴增體系（20 μL）:2 ×EasyTaq PCR SuperMix 10 μL,ddH2O 7 μL,上、下游引物各 1 μL,DNA模版1 μL;PCR程序:94℃,10 min;94℃,30 s;54℃,30 s;72℃,1 min;35個循環;72℃,8 min。擴增產物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像

系統觀察并記錄結果。

2.5 藥物敏感性試驗 在無菌條件下挑取經16S rRNA鑒定的單菌落,接種于滅菌的普通營養培養基中,37℃震蕩培養至指數生長期。取細菌培養液100 μL均勻涂布于普通營養瓊脂平板上,將藥敏紙片貼到涂好菌液的平板上,37℃培養12 h,測量抑菌圈直徑大小,根據美國CLSI手冊判定藥物的敏感性[4]。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳,對于擴增片段大小與預期片段相符的,將PCR產物送奧美德諾生物技術公司進行測序,并將測序結果在 NCBI上與已知標準序列進行比對,從而鑒定細菌種屬和耐藥基因亞型。

表1 PCR擴增引物

3 結果

3.1 培養結果 53份病料共分離出30株大腸桿菌。分離菌在LB瓊脂平板上為表面光滑、圓形隆起、邊緣整齊、半透明的灰白色菌落;在麥康凱瓊脂平板上為光滑濕潤、圓形隆起、邊緣整齊的粉紅色中等大菌落;在三糖鐵瓊脂斜面底層由紅色變為黃色、產氣、斜面也變黃。同時革蘭染色鏡檢,可看到紅色、兩端鈍圓的短桿菌,多數為單個存在,少數成對出現。

3.2 藥敏試驗結果 從表2中可以看出,30株細菌對32種抗生素耐藥性檢測發現,分離的鴨源大腸桿菌耐藥情況嚴重,青霉素、苯唑西林、四環素、克林霉素和利福平的耐藥率達到100%;氨芐西林、阿莫西林、多西環素、鏈霉素、氯霉素和復方新諾明的耐藥率達到75% 以上,其中氨基糖苷類中卡那霉素和鏈霉素耐藥嚴重,而阿米卡星不耐藥;同時,從表3中可以看出,分離的大腸桿菌多重耐藥情況嚴重,分離菌均對6種及以上抗生素表現出耐藥,其中對11種及以上抗生素表現出耐藥性的菌株占76.7%（23/30）,對21種及以上抗生素表現出耐藥的菌株占16.7%（5/30）。

表2 鴨源大腸桿菌藥敏試驗結果

表3 鴨源大腸桿菌多重耐藥結果

3.3 耐藥基因檢測結果 30株鴨源大腸桿菌中,29株大腸桿菌攜帶四環素耐藥基因Tet,檢出率為96.7%。5種 Tet基因中 Tet（B）檢出率最高,為63.3%,Tet（A）次之,為 60.0%,Tet（C）、Tet（M）的檢出率分別為30.0%、13.3%,未檢出Tet（K）。攜帶1種Tet耐藥基因的占40.0%,同時攜帶2種、3種、4種的分別占40.0%、10.0%和6.7%,不存在同時攜帶5種耐藥基因的菌株。從表4中可以看出四環素耐藥基因Tet和耐藥表型的關系,攜帶不同的Tet基因類型,四環素和多西環素耐藥的表型也不同。

從表5中可以看出,30株鴨源大腸桿菌中,15株檢出aac耐藥基因,檢出率為50.0%,其中 aac（3）-Ⅱc的檢出率為26.7%,aac（6′） -Ⅰb的檢出率為36.7%,同時攜帶兩種耐藥基因的菌株4株,占13.3%。同時,分離菌耐5種抗生素的個數不同,能檢出的acc耐藥基因也不盡相同。

4 討論

由于亂用、濫用抗菌藥物的現象在基層肉鴨養殖廠屢見不鮮,是造成鴨源大腸桿菌耐藥的重要原因之一。這不僅會影響疾病的治療,更加關系到人的安全,例如已有報道稱從養殖者和禽體內同時分離出相同的特定菌株,說明耐藥微生物或質粒可在家禽和人之間傳播[5]。本試驗發現,所有大腸桿菌均表現出對5種以上抗生素的耐藥性,大部分對10種以上抗生素表現出耐藥性。其中,對青霉素類和四環素類抗生素的耐藥率最高,均大于85%,對碳青霉烯類、β內酰胺酶抑制劑復合物、大環內酯類抗生素耐藥率較低。Wang[6-7]等對中國非人源的大腸桿菌耐藥性分析發現,其對四環素耐藥率最高,為66%,對氨芐西林耐藥率次之,為57%。刁有江[8]等對山東省分離鴨源大腸桿菌檢測發現,70%以上的大腸桿菌對氨芐青霉素、阿莫西林和多西環素耐藥,78.26%的分離株對8種或8種以上的受試藥耐藥。可見對于不同來源、不同地區的大腸桿菌,其耐藥性都很高,與本研究結果相似。同時本研究中鴨源大腸桿菌不僅對單一抗生素表現耐藥性多重耐藥的情況也很嚴重,提示對于大腸桿菌病的治療,進行抗生素藥敏試驗的篩查有一定的必要性。

表4 四環素耐藥基因Tet和耐藥表型的關系

表5 氨基糖苷類耐藥基因aac和耐藥表型的關系

我國對肉鴨四環素類耐藥基因的檢測較少。方志超[9]等對重慶地區40株鴨源致病性大腸桿菌的四環素類耐藥基因TetB、TetA、TetC、TetD的檢出率分別為80.0%、75.0%、55.0%、15.0%,TetK和TetL的檢出率均為0%,TetB基因的檢出率最高。Shin[10]等對韓國鴨源大腸桿菌攜帶耐四環素基因檢測中,Tet（A）攜帶率為 46.5%,Tet（B）次之為45.1%,Tet（C） 為 5.8%,Tet（A）的攜帶率最高。許瑞等[11]發現Tet耐藥基因中,Tet（B）與四環素類耐藥性表型相關性較好,與本研究結果相似。

本研究中,鴨源大腸桿菌對氨基糖苷類抗生素耐藥率為0% ～86.7%,其中鏈霉素耐藥率最高,慶大霉素和阿米卡星耐藥率最低,可能與養殖場使用鏈霉素較多,較少使用慶大霉素和阿米卡星有關。孫慧等[12]對禽源大腸桿菌氨基糖苷類耐藥性檢測發現,對鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素和阿米卡星的耐藥率分別為84.4%、57.1%、55.8%和40.2%,鏈霉素的耐藥性最高與本研究結果一致,其他抗生素與本研究有一定的差異性,可能與使用頻率有關。本研究中,絕大部分分離菌只耐1～2種氨基糖苷類抗生素;耐藥基因aac的檢出率也只有36.7%,只有aac（3） - Ⅱc、aac（6′） - Ⅰb 是北京地區肉鴨大腸桿菌攜帶率較高的耐藥基因。Nanarova[13]等發現氨基糖苷類乙酰化酶 aac（6′）和 aac（3）是導致智利和日本大腸桿菌氨基糖苷類耐藥的主要基因。于學輝等[14]對鴨源致病性大腸桿菌氨基糖苷類耐藥性和耐藥基因分析顯示,對鏈霉素的耐藥率最高為60%可能與aac基因的攜帶相關。

細菌耐藥性問題已經成為一個全球性關注的問題,目前有越來越嚴重的發展趨勢。而由于缺乏合理用藥的相關知識,養殖戶只能憑借經驗用藥,而能夠輕易地購買到各種藥物則對這種局面也具有推波助瀾的作用,因此畜禽菌株的耐藥性很大程度上是養殖過程中不規范使用抗菌藥物產生的不良后果,對畜禽疾病的防治和人類健康都有較大的威脅。因此,我們應結合藥敏試驗科學地選用抗菌藥物,并在規定的使用物種、劑量、期限等范圍內使用,同時養殖戶在用藥時一定要咨詢相關獸醫技術人員,在其指導下合理用藥。