貴州省豬源大腸桿菌對磺胺類抗菌藥物耐藥性及耐藥基因檢測

寇 宏,呂世明,譚艾娟,王 想,張順然,羅致茜,林 習,楊睿智

（1.貴州大學動物科學學院 ,貴州 貴陽 550025;2.貴州大學生命科學學院,貴州 貴陽 550025）

大腸桿菌是人和動物腸道中普遍存在的一類腸道共生菌群,也是一種人獸共患病的條件致病菌群,大腸桿菌也經常作為抗生素耐藥基因的貯存庫,在細菌耐藥性分析及耐藥基因傳遞研究方面起著非常重要的作用[1-2]。近年來,隨著規模養殖產業的迅速發展,大腸桿菌等細菌病原對于動物健康的危害日趨廣泛而復雜,這也就直接導致了抗菌藥物的大量使用,使細菌耐藥及耐藥基因傳遞逐漸成為廣泛關注的嚴峻問題[3-4],這給養殖業的健康發展埋下隱患,更為人與動物疾病的預防及治療帶來了極大的危害。

磺胺類藥物是廣譜抗菌藥,對革蘭陰性和革蘭陽性細菌均有抑菌作用[5]。自從百浪多息（Prontosil）在1935年發現磺胺類藥物以來[6],磺胺類藥物已經被廣泛應用于人類和動物細菌病及原蟲感染的治療[7]。由于磺胺類藥物有其獨特的優點:（效價高、毒副作用小、口服容易吸收、性質穩定、國內大量生產等[5-6],現仍在獸醫抗感染治療上發揮重要作用[8]。本研究通過對貴州省各個地區得到的66株豬源大腸桿菌,使用微量肉湯稀釋法進行藥敏試驗。使用PCR方法對sul1、sul2和sul3進行了檢測,為貴州省豬大腸桿菌病的科學防控提供理論依據,也為獸醫臨床磺胺類藥物的合理應用提供科學依據,從而減少或降低抗生素抗性對人類及動物健康造成的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 試驗菌株由2012年從貴州省安順（9株）、銅仁（11 株）、六盤水（11 株）、遵義（11株）、畢節（13株）、黔東南（11株）6個地區的部分規模化養豬場采集樣本,并由貴州大學藥理實驗分離純化,保種66株豬源大腸桿菌。標準菌株大腸桿菌ATCC25922,購自中國獸醫藥品監察所。

1.2 藥品及試劑 磺胺嘧啶（SD）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺噻唑（ST）、磺胺甲噁唑（SMZ）、磺胺間甲氧嘧啶（SMM）,均購自大連美侖生物技術有限公司;LB肉湯,購自北京奧博星生物科技有限責任公司;伊紅美蘭瓊脂（EMB）,購自上海博微生物技術有限公司;50×TAE電泳緩沖液、DM-2 000 DNA Marker、2 × Tag PCR Master Mix,均購自北京康為世紀生物科技有限公司;GoldView核酸指示劑購自Solarbio公司。

1.3 PCR擴增產物根據GenBank上登錄的sul1基因,利用Premier 5.0軟件設計1對sul1特異性引物,而sul2、sul3引物參照周萬蓉等[9]設計,引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（詳見表1）。

表1 sul基因引物序列

1.4 方法

1.4.1 藥敏試驗 以ATCC25922為藥敏質控細菌,根據美國臨床實驗室標準化委員會CLSI 2009年版標準,采用微量肉湯稀釋法測定66株豬源大腸桿菌對5種磺胺類抗菌藥的最小抑菌濃度（MIC值）。MIC值≥512為耐藥菌株,≤256為敏感菌株。

1.4.2 sul基因檢測 細菌DNA模板的制備:參照孫碩等[10]方法采用煮沸法提取66株大腸桿菌總DNA作為模板。

PCR反應體系:采用12 μL反應體系,2×Tag PCR Master Mix 5 μL,DNA 模板 5 μL,上下游引物各 0.5 μL 共 1 μL,滅菌蒸餾水補足 12 μL。

PCR反應條件與產物電泳:94℃ 5 min預變性,94℃ 50 s變性,56℃退火,72℃ 50 s延伸,32次循環。配制1.5%的瓊脂糖,90 V電泳40 min。在紫外照膠儀下檢測PCR產物。

1.4.3 擴增產物的序列測定 將擴增出有sul1、sul2、sul3目的條帶的可疑PCR產物。送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行單向測序,并與NCBI基因庫已經登錄的sul基因進行 BLAST比對。

2 結果

2.1 貴州省66株豬源大腸桿菌藥敏試驗檢測結果

試驗菌株對磺胺類抗生素藥敏情況如表2,其中對磺胺二甲嘧啶耐藥率為93.94%,其次是磺胺甲噁唑和磺胺噻唑分別為86.36%、89.39%,磺胺間甲氧嘧啶和磺胺嘧啶分別為84.85%、80.30%。試驗菌株對5種磺胺類抗生素中的耐藥率均超過50%。表明貴州省豬源大腸桿菌對磺胺類藥物耐藥現象十分嚴重。

表2 66株大腸桿菌對5種藥物的耐藥情況

2.2 sul基因PCR檢測結果 3種sul耐藥基因的陽性擴增片段如下圖1所示。所擴的片段大小與目的片段相一致,將擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測序,所測序結果與GenBank上登錄的sul基因序列BLAST比較結果,其同源性均達到99%。表明擴增產物為3個sul基因。

圖1 sul基因PCR擴增結果

2.3 貴州省66株豬源大腸桿菌耐藥基因檢測結果 通過PCR方法對66株豬源大腸桿菌進行sul1、sul2及sul3三種基因的檢測（表3）。試驗結果顯示,3個耐藥基因的檢出率為100%（66/66）。其中sul1的檢出率為 89.4%（59/66）,sul2的檢出率為77.3%（51/66）,sul3 的檢出率為 100% （66/66）。只同時攜帶sul1和sul2的菌株檢出率為0（0/66）,只同時攜帶sul1和sul3的菌株檢出率為15.2%（5/66）。只同時攜帶sul2和sul3的菌株檢出率為3.0%（2/66）。同時攜帶sul1、sul2和sul3的菌株檢出率為74.2%。

表3 66株大腸桿菌中磺胺類藥物主要耐藥基因的分布

2.4 耐藥表型與耐藥基因攜帶的關系 由表4可知,sul3基因的攜帶率為100%,sul1+sul2+sul3基因型的檢出率在73%以上,對磺胺間甲氧嘧啶耐藥的大腸桿菌此類型基因攜帶率為81%,因此,此類基因的攜帶在耐磺胺類藥物的大腸桿菌中起主要作用,與菌株的耐藥性關系明顯。sul1、sul2基因型的單獨檢出率為0,sul3的單獨檢出率最高為8%,最低為4%;基因型和 sul1+sul2、sul1+sul3、sul2+sul3最高檢出率分別為0、16%、4%。

表4 耐磺胺類藥物的大腸桿菌耐藥表型與耐藥基因檢出情況比較

3 討論

3.1 抗菌藥物至今僅僅使用了70多年,很多曾經可以輕易治療的細菌感染性疾病現在已經很難治療。很多曾經可以用一種藥物治療的傳染病目前已經成為嚴重的公共衛生安全問題[11]。耐藥性,特別是多重耐藥菌的不斷出現,給人和動物的治療帶來極大的困難[12]。

由藥敏試驗結果可知,66株豬源大腸桿菌對5種磺胺類藥物:磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧、磺胺噻唑、磺胺甲噁唑、磺胺間甲氧嘧啶的耐藥百分率分別為84.85%、93.94%、86.36%、89.39%、80.30%,此結果表明,貴州省各地區磺胺類藥物耐藥十分嚴重。與王紅寧等[13]研究四川規模化豬場分離的大腸桿菌對磺胺類藥物耐藥率26.1%相比,明顯上升;與劉開成等[14]從山東、內蒙古、山西分離到的161株豬源大腸埃希菌對磺胺異噁唑（SF）和新諾明（SMZ）的耐藥率分別為91.30%和90.06%,基本一致;與沈憲文等[15]分析吉林省部分地區仔豬大腸桿菌耐藥性對磺胺異噁唑（SF）耐藥率89.55%,對新諾明（SMZ）耐藥率86.57%相比,基本相一致。與植嬋萍等[16]報道的種鵝大腸桿菌對于磺胺類藥物復方新諾明的耐藥率在90%以上,基本一致。都表現出極高的耐藥水平。大腸桿菌對磺胺藥的耐藥率呈明顯的上升趨勢,一方面是由于藥物長期、大量、不合理的使用[17-18]。另一方面由于磺胺類藥物耐藥基因主要位于質粒上,細菌通過質粒在細菌間不斷的傳遞[19-20]。

3.2 耐磺胺類藥物大腸桿菌體內sul基因可通過轉座子、質粒和整合子在細菌間傳遞,該基因編碼可替代性的、對磺胺類藥物親和力更低的新二氫葉酸合成酶并高水平表達,從而導致細菌對磺胺類藥物的抗性[21]。目前發現的磺胺類耐藥基因sulR主要是sul1、sul2、sul3[22]。本試驗首次對貴州省各地區臨床分離的大腸桿菌進行了磺胺類藥物耐藥基因sul1、sul2、sul3分子檢測的研究。結果表明,磺胺類藥物耐藥基因普遍存在于貴州省各地區的耐磺胺類藥物的大腸桿菌中,sul2總的檢出率為77.3%,此結果與sul2基因在豬源大腸桿菌中分布是最廣泛的,在大腸桿菌對磺胺藥物耐藥性方面的研究具有重要的意義[21]結論相似。也說明sul2基因是豬源大腸桿菌對磺胺類藥物耐藥的主要決定簇[23]。在Perrten V等[24]的研究中,sul3基因的檢出率占sulR基因的三分之一,而在本試驗中sul3的檢出率為100%,與前者相比sul3的檢出率有所上升。說明sul3基因在耐磺胺藥菌株中所占比重有所上升。其中最主要的磺胺耐藥基因同時攜帶兩種基因型的菌株為18.2%,同時攜帶3種基因型的菌株為74.2%。由此可見,磺胺類耐藥基因在貴州省各地區廣泛存在,應給予足夠的重視。并且本試驗檢測的磺胺類耐藥基因攜帶率比較高,究其原因可能耐藥基因是通過質粒或染色體進行了水平散播,有待深入研究加以證實。