疑似A型豬內源性逆轉錄病毒致腫瘤病例

孫偉峰,王 貞,梁靜泊,劉海坤,馬譽蕓,蓋新娜,郭 鑫

（中國農業大學動物醫學院 農業部動物流行病學重點實驗室,北京 海淀 100193）

2018年1月,河北某豬場57日齡左右仔豬群出現批量死亡,個別表現神經癥狀。豬場曾進行過豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環病毒2型、口蹄疫病毒及沙門菌的常規疫苗免疫。在病死仔豬剖檢過程中,發現1頭仔豬的胸、腹腔內,尤其是腎臟、脊柱兩側,布滿了大量、大小不等的白色腫瘤結節。該仔豬肺臟、腎臟、腹股溝淋巴結中PRRSV、CSFV、PRV等病原的核酸檢測結果均為陰性。我們對該病例進行了進一步的病原檢測,現報告如下。

1 大體剖檢病變

死亡仔豬外觀未發現皮膚出血、發紺等病理現象。剖開仔豬胸、腹腔后可觀察到其肺門淋巴結上布滿灰白色的結節狀突起;沿脊柱兩側腫瘤數量較多,分布集中（見中插彩版圖1B中黑色箭頭所示）;整個腎臟表面布滿突出表面的白色腫瘤結節（見中插彩版圖1A）。

2 病理切片觀察

將病變的腎臟組織制成病理切片（見中插彩版圖2）。在低倍鏡下可見,病變腎臟的基本結構已破壞,部分腎小管已壞死崩解（見中插彩版圖2B中黑色箭頭所示）,大量腫瘤細胞沿腎小管間隙呈浸潤式生長（見中插彩版圖2A中黑色箭頭所示）;部分區域腫瘤細胞已完全取代正常腎組織（見中插彩版圖2A中白色箭頭所示）。腎小管上皮細胞重度水泡變性（見中插彩版圖2C中黑色箭頭所示）,腫瘤細胞為大、中、小淋巴細胞,形態多樣,核分裂相多見（見中插彩版圖2D中黑色箭頭所示）。

3 病原檢測

取腫瘤組織進行研磨,提取總RNA,去除gDNA后進行反轉錄。用特異性引物進行PCR擴增（上游引物:5′-ATGCATCCCACGTTAAGCTGGC-3′,下游引物:5′-CTAGAGGTCAGTTTCTCCTTGGCTC-3′, 擴 增片段長度約2 kb）。經瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增條帶大小相符后（見中插彩版圖3）,切膠回收目的條帶,連接到p-EASY-blunt載體上,將重組質粒轉化入Trans-10感受態細胞,挑選陽性克隆進行序列測定。

序列比對結果顯示,擴增得到的序列與A型豬內源性逆轉錄病毒囊膜（PERV-A-env）基因序列的同源性達99%。

綜合病豬的大體病變情況、腎臟組織病理學變化及病原核酸檢測結果,判斷該病例疑似為由PERV-A感染引起的淋巴肉瘤。

圖3 env基因的PCR擴增

4 討論

PERV屬于逆轉錄病毒科正逆轉錄病毒亞科γ逆轉錄病毒屬,為哺乳動物類C型逆轉錄病毒,與貓白血病毒（Feline leukemia virus,FeLV）等同源性很高[1-2]。其基因組包括核心蛋白基因（pol）、多聚酶基因（gag）和囊膜基因（env）以及位于兩端的長末端重復序列（Long terminal repeat,LTR）,根據env基因的差異和體外細胞嗜性可將該病毒進一步分為 PERV-A、PERV-B和 PERV-C三個亞型[3]。

PCR檢測證實,中國小型豬基因組內普遍含有PERV前病毒基因,陽性率達100%,且普遍存在兩種以上亞型同時存在的現象。RT-PCR檢測證實,大部分實驗豬體內均存在PERV-A和PERV-B,但尚未檢測到PERV-C復制的豬群[4]。有學者對大白豬不同器官中PERV的3種結構基因進行半定量RT-PCR檢測,結果顯示,病毒基因在腎臟和肝臟中的拷貝數最多[5]。豬被認為是人體器官移植的最佳供體,但其基因組內攜帶的PERV前病毒基因在體外可感染HEK-293等多種人類細胞[6]。Lj等將健康成年豬的胰腺移植到裸鼠體內后可在裸鼠的多個臟器內檢測到PERV感染,證實PERV可經器官移植傳播并導致受體動物發病[7]。PERV也因此引起了研究人員的重視。

由于誘發腫瘤的因素非常復雜,病程較長,該病在臨床中難以發現,多見于屠宰場。PERV感染細胞后,單鏈RNA在逆轉錄酶的指導下合成雙鏈DNA中間體并整合到宿主細胞基因組內,隨宿主細胞染色體復制而復制,并可通過精液垂直傳播[8-9]。雖然刺激整合到宿主基因組內的前病毒基因產生感染性病毒粒子的因素尚未完全清楚,但該病的發生與豬的品種、個體差異及飼養管理水平差等因素有一定的關聯。

為監控及預防腫瘤的發生,養殖場應該加強飼養管理,提供充足的營養并飼喂不含致癌物質的飼料,以強化機體的免疫系統,增強抵抗疾病的能力;同時,做好診斷工作,當發現疑似PERV感染引發腫瘤的個體時應及時撲殺。未來,有望通過基因編輯技術去除豬基因組內的前病毒基因,以防止病毒基因通過垂直傳播危害后代仔豬群。