江西省豬鏈球菌臨床分離株毒力基因檢測及藥物敏感性分析

洪家兵,陶 政,黃奕雯,王 萍,張學良

（1.江西農業大學動物科學技術學院,江西 南昌 330045;2.南昌市農村綜合產權交易中心,江西 南昌 330038）

豬鏈球菌病是一種由豬鏈球菌引起的人獸共患傳染病,主要引起豬腦膜炎、關節炎、心內膜炎、敗血癥及突然死亡。隨著中國規?；B豬業的發展,豬鏈球菌病的流行情況呈逐步上升趨勢,該病已成為中國養豬生產中的常見病和多發病,對中國養豬業的發展有較大的威脅。豬鏈球菌是一種新出現的人獸共患病原菌,可通過被感染的豬或者受污染的生豬肉產品傳播給人。目前國內有不少關于人感染豬鏈球菌病的報道[1-2],豬鏈球菌病具有很重要的公共衛生學意義。

雖然現在已有許多的豬鏈球菌疫苗被研究出來,且被廣泛的應用到養豬過程中。但由于豬鏈球菌包含有35個血清型（1型～34型及1/2型）及相當數量難以定型的菌株,而目前市場上的豬鏈球菌疫苗主要是針對致病性最強的2型豬鏈球菌,疫苗很難有效的幫助養殖戶預防豬鏈球菌病。故在養殖過程中養殖戶更傾向于采用抗生素來防治豬鏈

球菌病,但是伴隨著抗生素的大量使用,豬鏈球菌的耐藥形式也變得愈來愈嚴峻,這給豬鏈球菌病的防治帶來了巨大的威脅。目前國內外已經有不少關于豬鏈球菌的調查研究[3-5],江西省是養豬大省,江西地區此類報告罕見。本試驗采用K-B紙片法測定從2014-2016年江西地區不同規模化豬場疑似豬鏈球菌病的病例分離的62株豬鏈球菌對16種抗菌藥物的敏感性,并采用PCR技術對豬鏈球菌毒力基因進行檢測,以期為江西乃至全國豬鏈球菌病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 從2014-2016年江西各地區疑似豬鏈球菌病的病豬中分離得到的62株豬鏈球菌。

1.2 主要試劑及抗菌藥物藥敏試紙 2×Taq PCR Master Mix,購自南昌沃瑪科技有限公司;胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養基、瓊脂粉,均購自南昌天沃科技有限公司;阿莫西林（AMX,10 μg/片）、鏈霉素（SM,10 μg/片）、青霉素（PEN,10 μg/片）、四環素（TET,30 μg/片）、克林霉素（CM,15 μg/片）、頭孢唑啉（CZ,30 μg/片）、頭孢噻肟（CTX,30 μg/片）、復方新諾明（SXT,25 μg/片）、慶大霉素（GEN,10 μg/片）、阿米卡星（AN,30 μg/片）、恩諾沙星（ENR,5 μg/片）、萬古霉素（VAN,30 μg/片）、紅霉素（ERY,15 μg/片）、強力霉素（DOX,30 μg/片）、環丙沙星（CIP,5 μg/片）、氟苯尼考（FFC,30 μg/片）,均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 毒力基因檢測 根據文獻中[6-7]已公布的豬鏈球菌毒力基因 gdh、mrp、fbps、orf2、epf、sly 的引物序列,委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成6對特異性引物,引物序列信息見表1。采用25 μL的反應體系（2 ×Taq PCR Master Mix 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,DNA 模板2 μL,滅菌雙蒸水加至25 μL）,PCR反應條件:94℃預變性5 min;94℃變性 40 s, 各毒力基因（gdh、mrp、fbps、orf2、epf、sly）分別退火 40 s、35 s、35 s、45 s、40 s、30 s（退火溫度見表 1）,分別于 72 ℃ 延伸 45 s、35 s、45 s、50 s、45 s、90 s,共35個循環;72℃再延伸10 min。擴增產物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定,將電泳后凝膠放置在凝膠成像系統中,拍照并保存。

表1 毒力基因檢測引物

1.3.2 藥物敏感性試驗 采用世界衛生組織（WHO）推薦的K-B紙片法測定阿莫西林（AMX）、鏈霉素（SM）、青霉素（PEN）等16種抗菌藥對分離菌的抑菌圈大小。并參照美國臨床實驗室標準委員會（CLSI）公布的標準（表2）,通過抑菌圈的大小來判斷藥物的敏感性。以敏感、中介、耐藥3種形式對抑菌圈大小進行判定。

2 結果

2.1 毒力基因測定 通過PCR技術對62株豬鏈球菌的 6 種毒力基因 mrp、orf2、gdh、sly、fbps、epf進行檢測。結果表明,所有毒力基因均被檢出,谷氨酸脫氫酶gdh基因（62/100%）,溶菌酶釋放蛋白mrp基因（47/75.8%）,纖連結合蛋白 fbps基因（36/58.1%）,毒力相關序列 orf2基因（34/54.8%）,胞外蛋白因子epf基因（33/53.2%）,溶血素sly基因（14/22.3%）。毒力基因電泳圖見圖1～6。

2.2 藥敏試驗 用16種臨床常用抗菌藥物對分離得到的62株豬鏈球菌進行藥敏試驗,發現豬鏈球菌江西株對其均有不同程度的耐藥,主要對四環素、紅霉素、克林霉素、強力霉素的耐藥率較高,其中對四環素耐藥率最高,達到了96.78%;對頭孢唑啉、頭孢噻肟、阿莫西林及萬古霉素敏感程度較高,分別達到了85.49%、87.10%、82.26%和79.03%（見表3）。

表2 豬鏈球菌抗菌藥物藥敏試驗結果判定標準

圖1 豬鏈球菌分離株mrp基因擴增結果

圖2 豬鏈球菌分離株fbps基因擴增結果

圖3 豬鏈球菌分離株orf2基因擴增結果

圖4 豬鏈球菌分離株epf基因擴增結果

圖5 豬鏈球菌分離株sly基因擴增結果

圖6 豬鏈球菌分離株gdh基因擴增結果

本次試驗分離的62株豬鏈球菌多重耐藥情況（見表4、圖7）。1耐菌株有1株,占1.61%;2耐菌株有2株,占3.23%;3耐到15耐菌株有56株,占90.32%;16耐菌株有3株,占4.84%。耐藥情況主要集中在3耐到11耐之間,48.39%分離株為四環素-紅霉素-強力霉素-克林霉素耐藥。

3 討論

據當前研究報道,豬鏈球菌的毒力因子主要包括:莢膜多糖（cps）、胞外蛋白因子（epf）、溶菌酶釋放蛋白（mrp）、谷氨酸脫氫酶（gdh）、纖連蛋白和纖連蛋白原結合蛋白（fbps）、溶血素（sly）、毒力相關序列orf2等。豬鏈球菌致病性強弱主要與毒力因子具有相關性,gdh和cps不僅能夠作為豬鏈球菌的種屬鑒定和血清分型,也是重要的毒力因子[8-10]。在強毒株中,mrp和epf的檢出率較高,但是在非致病豬鏈球菌中檢出率較低,所以把mrp和epf作為豬鏈球菌毒力強弱的一個參考標準[11-12]。曾巧英等[13]通過相關研究證明,mrp可以獨立作為2型豬鏈球菌的毒力基因。

表3 豬鏈球菌分離株對16種抗菌藥物的藥敏率 （%）

圖7 豬鏈球菌分離株多重耐藥情況

表4 豬鏈球菌分離株多重耐藥情況

了解江西地區豬鏈球菌分離株的毒力基因分布情況,對于江西地區豬鏈球菌病的防治具有重要意義。通過PCR檢測發現江西地區致病性豬鏈球菌分離株中的毒力基因型具有多樣性,主要的毒力基因為:谷氨酸脫氫酶gdh基因（62/100%）、纖連結合蛋白fbps基因（36/58.1%）、毒力相關序列orf2基因（34/54.8%）、溶菌酶釋放蛋白mrp基因（47/75.8%）。本試驗結果與王紅寶等[14]報道的山西地區,李小軍[15]報道的上海地區致病性豬鏈球菌的毒力基因分布情況相比存在較大的差異性,說明致病性豬鏈球菌毒力基因型具有一定的區域性,提示相關部門應該加強對豬鏈球菌病的檢疫防疫,以免造成大規模的暴發。

在當前的養殖過程中,抗生素被廣泛的應用于治療豬鏈球菌病。本試驗選取16種抗菌藥物,對分離得到的62株豬鏈球菌進行藥物敏感性試驗。結果表明,分離株對臨床使用的16種抗菌藥物均呈現不同程度的耐藥性,而且大多表現為多重耐藥,主要集中在3耐至11耐,表明江西地區豬鏈球菌耐藥性比較嚴重,主要以多重耐藥為主。整體上看,江西源致病性豬鏈球菌對如阿莫西林、頭孢類等的常用抗生素保持著良好的敏感性,但是耐藥率也比較高,均在10%以上,耐藥率高于金卉[16]對122株國內豬鏈球菌所檢測的4%,證明豬鏈球菌對常用治療藥物的耐藥性正在不斷增強;對萬古霉素敏感程度較高,但是由于此種抗生素毒副作用較大,臨床很少使用,一般作為其他藥物效果不佳或者無效時的備選用藥。青霉素過去作為治療鏈球菌病的常用藥物,本次試驗中多表現為低度耐藥,表明豬鏈球菌對青霉素耐藥性正在增強,需要引起注意;本次試驗中豬鏈球菌對克林霉素、紅霉素、四環素、慶大霉素、阿米卡星的耐藥性最為嚴重,這與金卉對8株豬鏈球菌江西分離株耐藥性檢測結果相似;這些數據表明,豬鏈球菌國內分離株對大環內酯類和林可胺類等抗菌藥物的耐藥性比丹麥、瑞典、日本等國家分離得到的豬鏈球菌更加嚴重,表明國內外豬鏈球菌的耐藥情況具有差異性[17-19]。伴隨著豬鏈球菌耐藥性的不斷增強,對于其耐藥性的監測也顯得尤為重要。本研究所采用的試驗方法、試驗材料和研究結果都具有一定的科學性,這為江西地區豬鏈球菌病的防治提供了理論依據。