新疆伊犁地區捻轉血矛線蟲種群I型β微管蛋白基因苯并咪唑抗藥性相關單核苷酸多態性調查

楊 新,雷衛強,邸文達,王春群,周彩顯,張宗澤,方 瑞,周艷琴,趙俊龍,胡 敏

（華中農業大學動物醫學院 農業微生物學國家重點實驗室,湖北 武漢 430070）

捻轉血矛線蟲是一種重要的小反芻動物寄生線蟲,呈世界性分布,致病性強。該線蟲可以感染多種反芻動物,尤其是綿羊和山羊,主要寄生于動物的真胃內,引起血矛線蟲病導致巨大的經濟損失[1]。由于沒有疫苗可用,捻轉血矛線蟲的防控主要依賴于化學藥物的使用,常用的化學藥物包括苯并咪唑類、大環內酯類及煙堿激動劑類[2]。由于長期以及不合理的使用這些化學藥物,近些年,國內外關于捻轉血矛線蟲抗藥性的報道越來越普遍[3-5]。苯并咪唑類藥物是使用時間最長的一類藥物,其抗藥性的產生是由捻轉血矛線蟲 I型β微管蛋白編碼基因的3個單核苷酸多態性（SNP）造成的,分別是167位點由苯丙氨酸變為絡氨酸（TT CTAC）[6],198位點由谷氨酸變為丙氨酸 （GAAGCA）[7],200位點由苯丙氨酸變為絡氨酸（TTCTAC）[8]。2017年7月,新疆伊犁地區某羊場疑似暴發捻轉血矛線蟲病,短時間造成數頭綿羊的死亡,通過剖檢,在死亡羊的真胃內發現大量紅色頭發絲狀的捻轉血矛線蟲。為了解該羊場捻轉血矛線蟲苯并咪唑類藥物抗藥性情況,以便于后續捻轉血矛線蟲病的有效防控,故在該場開展了捻轉血矛線蟲種群I型β微管蛋白基因苯并咪唑抗藥性相關單核苷酸多態性的調查研究。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 從新疆伊犁地區某羊場死亡的綿羊真胃中采集了捻轉血矛線蟲成蟲樣品,用生理鹽水充分清洗后,雌雄分開保存于70%酒精中,-20℃保存備用。

1.2 引物設計 參照Bott[9]和von Samson-Himmelstjerna[10]的方法,分別合成針對捻轉血矛線蟲核糖體第二內轉錄間隔（ITS-2）序列和I型β微管蛋白（β-tubulin）編碼基因序列的特異性引物（表1）,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成,擴增片段分別為 265 bp（ITS-2）和385 bp（β-tubulin）。

1.3 主要試劑及儀器 乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基硫酸鈉（SDS）,及三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）,購自上海國藥集團;蛋白酶K,購自賽默飛世爾科技有限公司;Wizard?DNA Clean-Up System基因組DNA純化試劑盒,購自Promega公司;10X PCR Buffer、dNTP、rTaq DNA 聚合酶等 PCR擴增用試劑,購自寶生物工程（大連）有限公司;Trans 2K Plus I DNA Marker、10 × DNA Loading Buffer,購自北京全式金生物技術有限公司;瓊脂糖、溴化乙錠,購自Sigma-Aldrich公司;PCR儀,購自北京東勝創新生物科技有限公司。

1.4 基因組DNA的提取 按照Gasser的方法分別提取了27條捻轉血矛線蟲雄蟲的基因組DNA[11],然后使用Wizard DNA Clean-Up System對提取的基因組DNA進行純化。

1.5 蟲體ITS-2序列的PCR擴增鑒定 反應體系:10X PCR Buffer 2.5 μL,dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL,上游引物（ITS-2-F;10 mmol/L）1.0 μL,下游引物（ITS-2-R;10 mmol/L）1.0 μL,Taq 酶（5 U/μL）0.3 μL,基因組 DNA 2.0 μL,加 ddH2O 至 25 μL。擴增條件:94℃預變性5 min,然后94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s,共35個循環,最后72℃延伸7 min。PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳后,經紫外透射儀觀察結果。

1.6 I型β微管蛋白基因的PCR擴增 反應體系:10X PCR Buffer 2.5 μL,dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL,上游引物（β-tubulin-F;10 mmol/L）1.0 μL,下游引物（β-tubulin-R;10 mmol/L）1.0 μL,Taq 酶（5 U/μL）0.3 μL,基因組 DNA 2.0 μL,加 ddH2O 至25 μL。擴增條件:94℃預變性5 min,然后94℃變性40 s、53℃退火40 s、68℃延伸40 s,共40個循環,最后68℃延伸7 min。PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳后,經紫外透射儀觀察結果。

1.7 數據分析 將27條捻轉血矛線蟲雄蟲的I型β微管蛋白基因PCR擴增產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序,測序后對序列信息進行分析,統計該捻轉血矛線蟲種群苯并咪唑類藥物抗藥性相關單核苷酸多態性情況。

2 結果

2.1 捻轉血矛線蟲ITS-2序列PCR擴增鑒定 使用捻轉血矛線蟲ITS-2種特異性引物對提取的27條雄蟲樣品進行PCR擴增,通過電泳鑒定,均出現大小為265 bp的特異性目的條帶,說明這27條雄蟲樣品均為捻轉血矛線蟲（見圖1）,可用于后續試驗。

圖1 ITS-2基因擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳

2.2 捻轉血矛線蟲I型β微管蛋白基因的PCR擴增 使用捻轉血矛線蟲I型β微管蛋白基因特異性引物對27條捻轉血矛線蟲雄蟲樣品進行PCR擴增后,通過電泳鑒定,均出現大小為385 bp的特異性目的條帶（見圖2）,說明成功擴增到I型β微管蛋白基因。對這27條捻轉血矛線蟲I型β微管蛋白基因PCR擴增產物進行測序,用于后續的單核苷酸多態性（SNP）分析。

圖2 I型β微管蛋白基因擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳

2.3 捻轉血矛線蟲苯并咪唑類抗藥性相關SNP的檢測 對27條捻轉血矛線蟲雄蟲樣品I型β微管蛋白基因序列的3個苯并咪唑類藥物抗藥性相關單核苷酸多態性進行分析后,發現這27條捻轉血矛線蟲雄蟲在167位點均為純合敏感型,沒有抗藥型存在;在198位點,22條蟲體（81.48%）為純合敏感型,3條蟲體（11.11%）為雜合抗藥型,2條蟲體（7.41%）為純合抗藥型;在200位點,25條蟲體（92.59%）為純合敏感型,2條蟲體（7.41%）為雜合抗藥型（見表2）。在這27條捻轉血矛線蟲雄蟲樣品I型β微管蛋白基因序列中共發現4種基因型（見中插彩版圖3）,分別是198純合敏感型及200位點純合敏感型（20;74.07%）、198雜合抗藥型及200位點純合敏感型（3;11.11%）、198純合敏感型及200位點雜合抗藥型（2;7.41%）和198純合抗藥型及200位點純合敏感型（2;7.41%）（見表3）。

表2 新疆伊犁地區捻轉血矛線蟲種群I型β微管蛋白167,198位點和200位點的單核苷酸多態性

表3 新疆伊犁地區捻轉血矛線蟲種群I型β微管蛋白的基因型及其頻率

3 分析與討論

本試驗首次調查了新疆伊犁地區捻轉血矛線蟲種群苯并咪唑類藥物抗藥性相關基因I型β微管蛋白基因序列的3個單核苷酸多態性位點（F167Y,E198A和F200Y）。結果表明,僅在198位點和200位點發現,抗藥性突變,且198位點抗藥性突變的頻率比200位點要高,沒有在167位點發現抗藥性突變,這與我國黑龍江、遼寧、內蒙古、河北、陜西、云南、廣西及湖北地區調查的結果一致[12],但在其他國家發現了167位點的抗藥性突變[13]。之前,薄新文等通過多重PCR檢測了我國不同地區捻轉血矛線蟲I型β微管蛋白基因200位點的突變情況,結果發現,新疆地區的捻轉血矛線蟲表現為敏感型,未發現抗藥型,而本文研究發現新疆地區已經出現純合抗藥型突變[14]。Barrere等報道,若一個種群中,有超過10%的個體攜帶抗藥基因型（包括一個位點出現純合抗藥型突變和兩個位點同時出現雜合抗藥型突變）,則認為這個種群存在抗藥性,不過該學者在調查過程中只發現167位點和200位點的抗藥型突變,并沒有198位點的抗藥型突變[15]。本研究中,新疆伊犁地區捻轉血矛線蟲種群198位點和200位點的抗藥基因型頻率為7.4%,雖然沒有超過10%,但是存在198位點的純合抗藥基因型,說明該地區還是存在苯并咪唑抗藥性的風險,需要引起我們的警惕,后續需要采取措施來進行控制。

除了分子生物學的方法,糞便蟲卵計數減少實驗（FECRT）和蟲卵孵化實驗（EHA）也被用在我國苯并咪唑類藥物抗藥性的調查。到目前為止,我國的部分省份開展了苯并咪唑類藥物抗藥性的調查,從調查的結果來看,我國江蘇、黑龍江、上海、寧夏、新疆等省份苯并咪唑類藥物抗藥性還是普遍存在的[4-5,16-19]。苯并咪唑類藥物在我國已經使用了數十年,據報道,一種新藥物一般使用10年左右就可能產生抗藥性[20],未來,我們需要在更多的省份和地區開展苯并咪唑類藥物抗藥性的調查,全面的了解我國苯并咪唑類藥物抗藥性現狀,以便及時采取措施進行控制。

在山羊和綿羊養殖業迅猛發展的今天,寄生蟲病仍然是制約養殖業發展的重要因素,由于長期使用化學藥物來進行寄生蟲病的防控,抗藥性問題越來越普遍和嚴重。本研究首次報道了新疆伊犁地區綿羊體內捻轉血矛線蟲種群苯并咪唑類藥物抗藥型基因突變的存在,需要引起該場及周邊養殖戶們的重視,采取相關飼養管理措施來減緩抗藥性的產生和發展,避免造成巨大的經濟損失。