犬表皮生長因子受體2胞外Ⅳ區（her-2-ECD-4）抗原表位分析及單克隆抗體制備

趙冰冰,劉 娜,肖 敏,常宏建,任曉麗,張 佩,雷 磊,牟 婧,劉 云

[1.東北農業大學動物醫學學院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室（外科）,黑龍江 哈爾濱 150036]

人表皮生長因子受體2（her-2,ErbB2）是人乳腺腫瘤靶向治療的重要治療手段[1]。人her-2蛋白序列N端胞外區（her-2 N-terminal extracellular domain,her-2-ECD）為前630,胞外區又分為4個亞區,Ⅰ（1-195）、Ⅱ（196-319）、Ⅲ（320-488）、Ⅳ（489-630）[2],其中Ⅳ區（her-2-ECD-4）為一段富含半胱氨酸的區域,臨床上已經在使用的曲妥珠單抗（Trastuzumab）即為針對人her-2-ECD-4的抗腫瘤藥物。自1998年美國FDA批準人源化曲妥珠單抗（Trastuzumab）用于臨床后,其已取得了令人矚目的效果,但臨床治療結果證明Trastuzumab雖然能一定程度上增加her-2陽性乳腺癌腫瘤患者的生存率,但是高達70%患者最終獲得性耐藥[3]。另外,對于her-2過表達的乳腺癌腫瘤患者,Trastuzumab的療效并不如預期試驗那么好,且具有一定的肝臟和腎臟毒性。犬her-2基因與人her-2基因具有很高的相似性,犬乳腺腫瘤在母犬中也具有一定的發病率,犬her-2基因同樣作為犬乳腺腫瘤的標記物,在臨床檢測和治療中具有一定的價值,然而,犬her-2過表達與犬乳腺腫瘤發展和預后之間的關系尚不明確,因此其在分子生物學、病理組織學及臨床病況數據等方面的信息還需進一步進行研究,以明確其與犬乳腺腫瘤之間的關系[4]。所以分析犬her-2-ECD-4蛋白的生物學信息,并制備其單克隆抗體,對犬乳腺腫瘤的檢測試劑盒及抗腫瘤藥物的開發具有指導作用,另外對犬是否能成為人乳腺腫瘤藥物改良的動物模型具有探究價值。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒、細胞及實驗動物 DH5α、BL21（DE3）購自北京全式金生物技術有限公司;原核表達載體pET-32a（+）和骨髓瘤細胞SP2/0由東北農業大學動物醫學學院預防獸醫學研究室凍存;犬乳腺腫瘤細胞系CHmm由日本東京大學農學部生命科學科大學院獸醫外科研究室饋贈。4周齡SPF級BALB/c雌鼠,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 主要試劑和儀器 羊抗鼠IgG酶標抗體和山羊抗兔IgG酶標抗體（辣根過氧化物酶HRP標記）,購自北京中杉金橋生物技術有限公司;HAT、HT、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑,購自Sigma公司（美國）。限制性內切酶購自 TaKaRa公司（中國大連）。DMEM完全培養基、胎牛血清,均購自 GIBCO公司;Anti-ErbB2 antibody,購自Abcom公司。

1.3 表位分析 利用TMHMM Server 2.0軟件分析跨膜區找到其胞外區,對比人her-2胞外區分區情況,確定犬her-2胞外區Ⅳ區蛋白序列,利用Prot-Param在線分析工具分析蛋白的理化性質。將得到的蛋白序列再用 DNAStar、sopma、SWISS-MODLE 等軟件分析,結合分析結果,確定該段蛋白序列可能的抗原表位。

1.4 犬her-2-ECD-4單克隆抗體制備

1.4.1 重組蛋白表達及免疫 將構建好的重組質粒轉入BL21,用IPTG誘導重組蛋白表達,超聲破碎菌體后發現其為部分可溶性表達,即選擇鎳柱純化重組蛋白,純化后的抗原蛋白透析濃縮后即用于免疫小鼠。小鼠免疫程序為初次免疫,用弗氏完全佐劑和抗原蛋白混合,皮下多點注射;第二次免疫,用弗氏不完全佐劑和抗原蛋白混合,腹腔注射;第三次免疫,只用抗原蛋白,腹腔注射;最后的加強免疫用抗原蛋白,腹腔注射。

1.4.2 細胞融合和篩選陽性融合細胞 將免疫小鼠眼球采血后脫頸處死,取其脾臟研磨后與培養狀態良好的生長至80%骨髓瘤細胞sp2/0融合,并加到鋪好飼養層細胞的96孔培養板里,每孔100 μL。待融合細胞生長至孔的2/3時,用間接ELISA檢測方法檢測雜交瘤細胞陽性情況。

1.4.3 單克隆抗體亞類鑒定應用 SBA ClonotypingTMSystem/HRP抗體亞類鑒定試劑盒（Southern Biotech公司）鑒定單克隆抗體的亞類。具體方法:取已包被的間接ELISA板,以雜交瘤細胞上清為一抗,以1∶2 500倍稀釋的 HRP標記的羊抗鼠 IgA、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3 為二抗 ,TMB 室溫避光顯色15 min,讀取OD450nm。

1.4.4 單克隆抗體識別表位鑒定 利用DNAStar的Protein分析出的抗原性分布將目的蛋白序列分成幾個小段分別合成多肽,該多肽由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。將合成好的多肽按照說明書處理后包被96孔酶標板,用ELISA方法檢測雜交瘤細胞上清識別的多肽部位。合成的多肽序列如下,見表1。

表1 合成犬her-2-ECD-4多肽序列

1.4.5 腹水制備和純化 無菌液體石蠟注入小鼠腹腔,1周后將篩選過的陽性雜交瘤細胞注入小鼠腹腔,5×105個/d。7～10 d后小鼠腹部隆起,取腹水,離心去除油脂沉淀,測定效價。置-80℃保存。采用辛酸-飽和硫酸銨方法純化抗體。

2 結果

2.1 犬her-2蛋白序列分析 犬her-2胞外區分析顯示,犬的her-2胞外區氨基酸序列為1-652（見圖1）。結合犬her-2胞外區三級結構建模（見圖2）,最終確定犬her-2-ECD-4氨基酸序列為cyplcahghc wgpgptqcvn csqflrgqec veecrvlqgl preyvkdryc lpchsecqpq ngsvtcfgse adqcvacahy kdppfcvarc psgvkpdlsf mpiwkfadee gtcqpcpinc thscadldek gcpaeqrasp vt共142個氨基酸。

圖1 犬her-2蛋白質序列TMHMM分析

圖2 犬her-2-ECD SWISS-MODLE三級結構建模

2.2 犬her-2-ECD-4蛋白理化性質分析 犬her-2-ECD-4蛋白理化性質分析顯示,犬her-2蛋白在該區段半胱氨酸含量為14.1%,而脯氨酸含量則較低,為10.6%。等電點為5.25。它的不穩定指數為56.69。親水性為-0.376,是親水性蛋白（見表2）。

2.3 犬her-2-ECD-4表位預測 結合蛋白一級結構分析、二級結構分析及三級結構建模,通過對氨

表2 犬her-2-ECD-4蛋白理化性質分析

圖3 犬her-2-ECD-4sopma二級結構預測,其中c為無規卷曲,t為β-轉角

圖4 犬與人her-2-ECD-4 SWISSMODLE三級結構建模

2.4 重組抗原鑒定 將重組蛋白進行Western Blot分析,顯色后目的條帶大小與預期符合,由圖5可知重組蛋白與人免疫原Anti-ErbB-2抗體具有良好的反應性。

圖5 犬her-2-ECD-4重組蛋白的Western Blot分析

表4 單克隆抗體表位鑒定

2.5 單克隆抗體Western Blot鑒定 用免疫印跡分析的方法,以犬乳腺腫瘤細胞系CHmm中提取的蛋白為抗原,各株雜交瘤細胞上清為抗體,人免疫原anti-ErbB-2為陽性對照,pet-32a（+）空載體為陰性對照進行分析,顯色后結果如下圖6。結果顯示,本試驗中獲得的雜交瘤細胞株上清與anti-ErbB-2在同樣的位置出現特異性條帶,且空載體部分無條帶,表明其為識別犬her-2的特異性抗體。

圖6 單克隆抗體Western Blot

2.6 單克隆抗體亞類鑒定 用Southern Biotech公司的SBA ClonotypingTMSystem/HRP抗體亞類鑒定試劑盒,對所獲得的3株單抗進行抗體亞類鑒定,結果如表3所示。

表3 MAb的亞類鑒定

2.7 單克隆抗體表位鑒定 用間接ELISA的方法,將合成的多肽對篩選出的雜交瘤細胞上清進行鑒定,結果發現,3-1B10和4-1B2均識別同一段多肽即hykdppfcv,6-1C7識別的多肽序列為pchsecqpqngs。如圖表4。這兩端多肽序列包含本文預測出的抗原表位 ykd（56-58）和 ecq（80-82）。

2.8 腹水效價測定及純化 將得到的腹水從1∶100開始進行倍比稀釋,用間接ELISA方法檢測,以小鼠陰性血清作為陰性對照,陽性血清為陽性對照,P/N比值大于2.1的最大稀釋倍數為其效價。見表5。

表5 腹水效價測定

將得到的腹水用辛酸-飽和硫酸銨方法進行純化,經過純化透析等過程后,將得到的抗體SDSPAGE檢測,并用BCA試劑盒測其濃度,結果顯示,其在25 kD左右有1條輕鏈,在48 kD-63 kD之間有一條重鏈,見圖7,濃度測定結果顯示其濃度為3.037 mg/mL。

圖7 抗犬her-2單克隆抗體SDS-PAGE

3 討論

在人類醫學中,利用抗體治療和檢測相關腫瘤疾病已經成為一種常見的對抗癌癥的方法[5],其中,曲妥珠單抗（Trastuzumab）即是一個典型的例子。相比于人類醫學中腫瘤靶向治療手段的不斷深入和發展,目前獸醫上針對犬乳腺腫瘤還沒有最佳的治療方法,通常人類臨床的治療方案如被動免疫,于獸醫上也沒有實現[6]。在獸醫學中,除了利用免疫組化、熒光原位雜交及Hercept Test試劑盒等方法檢測臨床犬乳腺腫瘤中her-2表達情況外,尚無蛋白信息學方面的分析。

生物信息學在預測蛋白質結構和功能以及確定蛋白質生物學特性等方面具有重要作用,已廣泛應用于蛋白質抗原表位的分析預測[7]。在本研究中,用TMHMM Server 2.0分析NCBI上提供的犬her-2蛋白序列,犬her-2-ECD為1-652,比人該區域多了30個氨基酸。通過氨基酸序列的對比,我們得到了犬her-2-ECD-4的氨基酸序列。已知人her-2-ECD氨基酸序列中Ⅰ區和Ⅲ區上含有受體潛在配體結合位點,Ⅱ區和Ⅳ區富含半胱氨酸,參與同源二聚體和異源二聚體的形成[8],猜測犬的蛋白序列也具有相同的情況。在理化性質分析結果中可以看到犬her-2-ECD-4與人一樣為富含半胱氨酸的區域,容易形成鏈與鏈之間的相互作用[9],結合二級結構分析,此區域中無規卷曲占比很大,為65.49%,而無規卷曲是易形成抗原表位的結構[10-11],另外其親水性為-0.376,是親水蛋白,在抗原蛋白制備時易于得到可溶性蛋白,方便后面的蛋白純化工作,由此可見,該區域為制備犬her-2抗體的較理想抗原。

在實際應用中,抗原的表位仍需要具體的實驗驗證。本研究獲得了3株能持續分泌抗體的雜交瘤細胞株,通過驗證發現它們識別的多肽序列中含有本文預測的抗原表位序列,這一結果不僅一定程度上說明該實驗獲得了針對犬her-2的特異性單抗,且也說明了蛋白生物信息學分析方法可為該方向的實驗研究提供基本的方向和思路。

目前,Trastuzumab在人醫臨床中已沿用多年,在此基礎上的抗her-2疫苗也在臨床試驗中,如NeuVaxTM,CD8+T-cell-eliciting vaccine和AdHER2/neu dendritic cell vaccine[12-13]。目前報道過兩種犬嵌合型抗體:一種是西妥昔單抗,是小鼠-人嵌合抗表皮生長因子受體抗體,另一種是利妥昔單抗樣抗體,可靶向B細胞抗原分化簇[14-15]。但上述兩種抗體成本太高,限制了其在獸醫腫瘤學中的發展。Rungsipipat等人于實驗中證實了人her-2抗體與犬乳腺腫瘤組織之間具有交叉反應[16],這說明her-2單抗作為檢測或治療手段應用于獸醫臨床的可行性,但人源性單抗可能會因其特異性和免疫原性引發用藥動物過敏[17],所以人源性單抗用于犬乳腺腫瘤的治療可能不會獲得較好的治療效果,另外犬her-2過表達與犬乳腺腫瘤發展的關系沒有人那么明確,事關癌癥相關標記物和通路時,由人類醫學過渡到獸醫學需謹慎從事。犬乳腺腫瘤中her-2的診斷和生物學作用以及其是否作為乳腺癌her-2過表達模型均需要進一步探究[18]。那么針對犬的her-2單抗就具有了研究價值。