淺析微生物菌種保藏方法

劉巍 劉慶慶

摘 要： 微生物種系，是生物學研究的常用材料以及工業生產的重要原料，保持微生物種系的穩定是保證后續實驗和生產順利進行的前提，因此微生物菌種的保藏是微生物研究的一項重要課題。

關鍵詞： 微生物；菌種保藏

0 引言

菌種保藏是微生物學檢驗工作中的一項常規技術。其目的是在人工創造的條件下盡量減慢或停止菌種的生長繁殖，使其處于休眠狀態，減低菌種的變異率，在較長時期內保持著生活能力，以便為擴大微生物育種及微生物學研究提供大量可靠的優質菌種。菌種的妥善保藏是良好的實驗室管理和實驗質量的重要保證。標準菌種管理包括：標準菌種來源、菌種管理制度、標準菌種實驗要求及注意事項。現就微生物菌種保藏方法做如下探討。

1 微生物菌種保藏原理

各種微生物菌種保藏方法的主要原理是根據不同微生物的生理生化特點，人為創造缺氧、低溫或者干燥的條件，降低微生物的新陳代謝， 使其生命活動基本處于停滯或者休眠狀態，停止生長繁殖的微生物，其遺傳物質自然會更加穩定。因此微生物的性狀在這種條件下保持穩定，達到維持種系的目的。以下介紹的保存方法大致可以分為兩類：

（1）在基質中低溫的保藏方法，包括斜面、半固體穿刺、石蠟、沙土管保藏法。這類保藏方法通過稍降低溫度輔以缺氧及減少養分供給等方式，以降低微生物的新陳代謝，從而達到較長時間保藏菌種的目的。

（2）在保護劑中超低溫保藏，也包括真空干燥凍存法。通過保護劑減少溶液結晶， 平衡微生物細胞內外滲透壓，保證微生物的生存，同時把溫度降低到冰點以下使微生物的新陳代謝完全停止。這類方法雖然操作復雜，要求的硬件條件較高， 但可以實現很長時間保持菌種穩定的目的。

2 微生物菌種的保藏方法

2. 1 定期移植法

亦稱傳代培養保藏法，包括斜面培養、穿刺培養、液體培養（保藏厭氧細菌用）等。將菌種接種于適宜的培養基中，最適條件下培養，待生長充分后，于4～6℃進行保存并間隔一定時間進行移植培養。保藏時間依微生物的種類不同而不同。此法操作簡單，但保存時間短，需要經常移種，易于變異。只能作為菌種的短期保藏。

2. 2 液體石蠟保藏法

亦稱礦物油保藏法。選用優質化學純液體石蠟，采用以下兩種方式進行滅菌：（1）121 ℃濕熱滅菌30 min，置40℃恒溫箱中蒸發水分，經無菌檢查后備用。（2）160 ℃干熱滅菌2 h，冷卻后，經無菌檢查后備用[2]。把液體石蠟注入已長好菌的斜面上并高出斜面頂端1 cm，使菌種與空氣隔絕。將試管直立，置低溫（4～6℃） 干燥處或室溫下保存。保藏期間應定期

檢查，如培養基露出液面，應及時補充無菌的液體石蠟。

此方法簡便有效，保藏時間2～10年，可用于絲狀真菌、酵母、細菌和放線菌的保藏。特別對難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養基上形成孢子的擔子菌等的保藏更為有效。缺點是必須直立存放，占空間大，不便攜帶。某些以石蠟為碳源，或對液體石蠟保藏敏感的菌株都不能用此法保藏。

2. 3 沙土管保藏法

取60～80 目河沙，用吸鐵石吸去鐵質，用10%鹽酸浸泡24h后棄鹽酸，用水洗至中性，將沙子烘干備用。取地面下40～60 cm 非耕作層貧瘠且粘性較小的土，研碎后100 目過篩并用水洗至中性，烘干備用。將處理后的沙、土按質量比2∶1 混合。混勻的沙土分裝入安瓿管或小試管中，高度為1 cm 左右，塞好棉塞，121 ℃濕熱滅菌30 min，無菌檢驗合格后方可使用。把制備好的菌懸液分裝每支沙土管0.5 mL，放線菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。塞好棉塞放入盛有干燥劑的容器中，用真空泵抽去水分。抽檢合格后封口，存放于低溫（4～6℃）干燥處保藏，每隔半年驗證1 次。

本法方法簡便，設備簡單，適用于產孢子和有芽孢的菌種保藏，可保存兩年，但對營養細胞不適用。由于在真空干燥過程中，機械力容易造成孢子的死亡，因此在保藏放線菌和部分真菌的孢子時最好用干法接種。

2. 4 真空冷凍干燥保藏法

2. 4. 1 好氧菌冷凍干燥管的制備

安瓿管用2%鹽酸浸泡過夜，用自來水沖洗并用蒸餾水浸泡至pH 中性，烘干后加入脫脂棉塞，滅菌備用。保護劑可選擇血清、脫脂牛奶和海藻糖等。將培養好的菌體或孢子加入保護劑制成菌懸液，分裝于安瓿管中，每支0.2 mL。然后放入冰箱冷凍2 h 以上，達到-20～35℃左右。再置于冷凍干燥箱內進行冷凍干燥直至其中水分被抽干，時間一般為8～20 h。將安瓿管在真空條件下熔封，低溫或常溫保藏。

2. 4. 2 厭氧菌冷凍干燥管的制備

主要程序與需氧菌操作相同，注意保護劑的選擇和準備，保護劑使用前應在100 ℃的沸水中煮沸15 min 左右，脫氣后放入冷水中急冷，除掉保護劑中的溶解氧。

此法為菌種保藏方法中應用最廣泛的，是國際菌種保藏機構通常采用的方法之一，幾乎所有的微生物均可采用此法保藏。適用于菌種長期保存，一般可保存數年至十余年[2]。方便之處在于因冷凍干燥管無需低溫保藏，所以運輸方便，但此法所需設備要求高，操作復雜，費用昂貴。

2. 5 冷凍保藏法

2. 5. 1 普通冷凍保藏技術（ - 20℃）

將培養好的固體或液體菌種用橡膠塞封口，置于普通冰箱中保藏。這一方法雖操作簡單但不適宜長期保藏。

2. 5. 2 超低溫冷凍保藏技術（ -60～- 80℃）

將生長至對數生長中后期的微生物細胞，加入新鮮培養基使其懸浮，然后加入等體積的20%甘油或10%二甲基亞砜作為冷凍保護劑，混勻后分裝入冷凍管或安瓿管中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。若干細菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5 年而活力不受影響。

2. 5. 3 液氮超低溫保藏法

主要程序與超低溫冷凍保藏技術（-60～-80℃）相同。需注意分裝好的安瓿管在放入液氮前需用控速冷凍機預凍，冷凍速率以1℃/min 為宜，冷凍到-35℃。如果無控速冷凍機，可將安瓿管置于-70℃冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。使用時從液氮罐中取出，立即放置38～40℃水浴中使其溶化，而后直接將其接種到適宜的培養基中即可。此法存活率高，穩定性強，保藏時間長，是長期保藏菌種的最好方法。適用于各種菌種的保藏，特別適用于難以用真空干燥保藏等方法保藏的菌種。此法需定期向液氮罐中補充液氮，以保證液氮罐中的溫度。

2. 6 基因工程菌的保藏

2. 6. 1 穿刺保藏法

在容量為2～3mL旋蓋玻璃小瓶中加入相當于約2/3 容量的LB 瓊脂，滅菌后備用。用接種針挑取被保藏菌株單菌落，針刺至瓶底，在適當溫度下培養過夜后避光保藏于4℃或室溫。穿刺法可保藏細菌2年之久。

2. 6. 2 甘油管冷凍保藏

在細菌培養物中加入適量甘油（使甘油終濃度為15%），分裝至保存管內，置于-20 ℃或-70 ℃冰箱中保藏。此法可保藏1～10 年。

2. 7 固定化技術

固定化的保藏技術是將真菌菌株事先包裹在藻酸鈣中并進行超低溫保藏的一種保藏技術。首先，制備真菌的孢子或菌絲的藻酸鹽的懸浮液，將懸液滴入藻酸鈣的溶液中，放置一段時間后，將菌絲或孢子的藻酸鈣小球轉移到高滲溶液中進行脫水，然后按照菌種保藏的一些常規方法保藏， 如液氮超低溫保藏、油管保藏、蒸餾水保藏等。固定化的技術方法已用于真菌酶制劑、生防菌株、生物降解等多個方面的研究。

結語

由于微生物的多樣性，每種菌種保藏方法都各有優缺點。根據菌種的生物學特性，科學的保藏菌種并嚴格按照標準菌種管理制度使用菌種，可以使實驗室檢驗工作得到進一步提升。

參考文獻

[1] 呂紅線，郭利美.工業微生物菌種的保藏方法[J].山東輕工業學院學報，2007，21（1）：52-55.

[2] 許麗娟，劉紅，魏小武.微生物菌種的保藏方法[J].現代農業科技，2008，（16）：99-101.