發育中小鼠大腦皮層GABA能神經元能障變化及對神經編碼的影響

葛榮靖 倪虹 申林 王其一

摘 要：目的 探討發育過程中能障變化規律及對小鼠大腦皮層GABA能神經元編碼能力的影響。方法 取生后6-12天（未睜眼）、15-22天（睜眼）小鼠，孵育腦片并用膜片鉗記錄皮層GABA能神經元電的生理特性。使用Clampfit10軟件記錄動作電位的能障（potential barrier， PB）、動作電位間距（inter-spike intervals， ISI），并分析結果。結果 發育過程中，小鼠大腦皮層GABA能神經元能障減小（P<0.01）、ISI縮短（P<0.01）。 PB與ISI之間始終呈線性相關。結論 小鼠大腦皮層GABA能神經元在生后發育過程中，發放動作電位的能障逐漸降低，神經元編碼能力上調。

關鍵詞：發育；GABA能神經元；能障；全細胞記錄

γ-氨基丁酸（GABA）是腦皮質中的主要抑制性神經遞質，由GABA能神經元合成并分泌，分布于大腦皮質各個區域[1]。GABA能神經的活動對腦功能具有重要的調節作用。在一些研究中，通過對神經元動作電位參數的量化分析來研究其編碼特性，如動作電位間距（inter-spike intervals，ISI），絕對不應期（absolute refractory period， ARP）、能障（potential barrier， PB）等[2，3，4，5]。本課題組之前研究了小鼠大腦皮層GABA能神經元動作電位在生后發育過程中的變化規律[6]：在發育過程中，皮層GABA能神經元動作電位的ISI縮短，ARP的縮短是重要的影響因素。這些變化使GABA能神經元的興奮性逐漸增加。

本研究將對皮層GABA能神經元興奮性發育做進一步探索。通過改變去極化刺激強度（閾刺激強度×0.7， ×0.85， ×1， ×1.25）誘發動作電位，通過預設刺激模式，當前一個動作電位產生并完全恢復后再施加與前次相等的去極化電流刺激，以此產生5組動作電位，分別各采樣20次，獲得5組連續動作電位群組，采用全細胞記錄方法，探討小鼠發育過程中內在特性的變化及對動作電位編碼的影響，為GABA能神經元發育的機制研究提供新的思路。

1 材料與方法[7]

1.1 實驗材料及實驗用液組成

1.1.1藥品：

Hepes（Sigma）；Mg2ATP（Sigma）；EGTA（Sigma）；Tris2GTP（Sigma）；Kclu（Sigma）；42Na2phosphocreatine（Sigma）。

1.1.2實驗動物選擇：

蚌埠醫學院實驗動物中心提供轉基因FVB-Tg（Gad GFP）45704 Swn/J小鼠，使用許可證【SYXK（皖2012-002）】。

1.1.3人工腦脊液（mmol/L）

3 KCl， 124 NaCl， 26 NaHCO3， 1.3NaH2PO4， 5 HEPES， 10 dextrose， 0.5 CaCl2和4 MgSO4 （95%O2和5%CO2充分氧合）。

1.1.4 電極標準液（mmol/L）

4 NaCl， 150 葡萄糖酸鉀， 0.5 EGTA， 10 HEPES， 1 Tris-GTP， 4 Mg2+-ATP （pH調至7.35；滲透壓295～305 mOsmol）。

1.2實驗方法

選用生后6-12天、15-22天的FVB-Tg（Gad GFP）45704 Swn/J小鼠，剪刀斷頭，快速剝離大腦，轉移至充分氧合的人工腦脊液，用振蕩切片機制作腦片標本約3-5片（400μm）。將腦片移至裝有充分氧合的人工腦脊液的培養皿中，保持環境溫度約35℃，孵育1小時[5]。 隨后將腦片轉移至IR-DIC光學顯微鏡下的記錄槽中，小槽內預先充灌35？C氧合的人工腦脊液，灌流速度約為40-50滴/分。通過全細胞記錄[5]（Axoclamp-2B 放大器，電流鉗模式，3 kHz高頻濾波），pClamp 10記錄信號并進行分析。

通過Clampfit10軟件設定刺激脈沖：5 ms去極化電流，逐步增加電流強度，至50%可能性產生動作電位時，此電流值設為閾刺激。在閾刺激基礎上，改變去極化電流強度（閾刺激強度×0.7， ×0.85， ×1， ×1.25）誘發動作電位。為了使閾刺激強度×0.7， ×0.85組可以正常誘發動作電位，故將閾強度預設為閾刺激強度×0.7組的刺激強度，反推出其他組刺激強度，獲得相應的動作電位波形，應用Clampfit分別對動作電位參數（PB、ISI值）進行測定（測量方法見后文述）。

1.3 實驗分組

小鼠出生后6-12天由于眼睛未振凱，設為未睜眼組；15-22天眼睛睜開，設為睜眼組[6]。

1.4PB和ISI的測定

能障（potential barrier， PB）：分別測得閾電位（threshold potential， Vts）及靜息電位（resting membrane potential， Vr ），其差值即為PB[2]。[圖1（A）]。

動作電位間距（ISI）：為相鄰兩動作電位峰值間的距離，其值與神經元產生動作電位的容量成反比。[圖1（B）]

1.5控制指標

在獲得的數據中，只選用靜息電位低于-65 mV的記錄納入統計分析。靜息膜電位、動作電位幅度和輸入阻抗的波動范圍在5%之內[8]。保持電極阻抗為5-6 M。

1.6 數據處理

實驗數據以均數±標準誤（ ±SE）表示，SPSS19.0統計軟件做方差分析，組間比較采用t檢驗， P <0.05為有統計學差異。

2、結果

2.1 GABA能神經元能障在發育中的變化

小鼠睜眼前后分別記錄大腦皮層GABA能神經元的序列動作電位。結果顯示，不同強度去極化脈沖所誘發的GABA能神經元的序列動作電位的PB在兩組間均存在顯著差異（P<0.01）。給予不同強度的刺激，睜眼組產生動作電位的PB均較未睜眼組減小[圖2]。

（A）在大腦皮層GABA能神經元測量能障的方法。測量閾電位（threshold potential， Vts）和靜息電位（resting potential，Vr ），其差值即為PB[2]；（B）動作電位間距（ISI）的測量方法。向細胞內輸入電流刺激神經元產生動作電位，測量相鄰動作電位峰值間的時間差 [6]。

在STi×0.7， ×0.85， ×1， ×1.25四種電流刺激強度下，睜眼組較未睜眼組Vts-Vr1、Vts-Vr2、Vts-Vr3、Vts-Vr4、Vts-Vr5均減小。*P<0.01，睜眼組與未睜眼組比較。

2.2 發育對GABA能神經元動作電位間距（ISI） 的影響

小鼠發育中，分別對睜眼前及睜眼后小鼠進行電生理記錄。隨著刺激強度變化，大腦皮層GABA能神經元發放的動作電位對應的ISI存在差異性，睜眼組較未睜眼組ISI縮短（P<0.01）。（圖3）：

2.3.發育中能障（PB）與動作電位間距（ISI）之間的關系

量化內在特性和動作電位編碼間關系。未睜眼組PB和ISI之間具有線性先關。四組刺激中相關系數分別為：sti×0.7（r2=0.92），sti×0.85（r2=0.96）， sti×1（r2=0.81），sti×1.25（r2=0.78）。睜眼組的PB和ISI之間也具有線性相關。四組刺激中相關系數分別為：sti×0.7（r2=0.91），sti×0.85 （r2=0.99），sti×1 （r2=0.92，P），sti×1.25 （r2=0.92）。（圖4）

在STi×0.7， ×0.85， ×1， ×1.25四種電流刺激強度下，可見睜眼組較未睜眼組ISI1、ISI2、ISI3、ISI4均縮短。*P<0.01，睜眼組與未睜眼組比較。

（A）未睜眼組，不同刺激強度誘發的動作電位的PB與ISI之間線性相關。（B）睜眼組，不同刺激強度誘發的動作電位的PB與ISI之間線性相關。

討論：

GABA是腦內重要的抑制性神經遞質，在維持神經系統內環境穩態有重要意義。神經精神性疾病多與GABA能神經元活動異常有關[9，10，11]。本研究對中樞神經系統GABA能神經元動作電位的內在特性及編碼模式進行研究，探討小鼠大腦皮層GABA能神經元的發育規律。

本實驗中量化研究了不同發育階段、不同刺激強度下的小鼠GABA能神經元的能障（PB）、動作電位間距（ISI）。研究發現，在發育過程中動作電位參數均呈動態變化，主要表現在①發育過程中，GABA能神經元動作電位的能障縮短，意味著靜息電位水平或最大復極電位水平與閾電位水平之間的差距減小，神經元興奮性增加。能障主要反映了GABA能神經元神經元閾電位水平，實質是Na+通道電壓依賴性的變化。能障減小，閾電位水平下移可使神經元興奮性增加。②發育中ISI縮短意味著單位時間內發放的動作電位個數增加，是GABA能神經元興奮性增加的結果，提示動作單位的編碼能力上調。編碼能力上調是情緒、學習、記憶等行為的神經信號基礎，也是動作電位的編碼重要形式[12-13]。③未睜眼組與睜眼組中，能障（PB）始終與ISI之間存在線性相關，提示這是一個動態的控制過程。PB通過什么機制調控ISI仍需進一步進行研究。

綜上，在發育過程中GABA能神經元動作電位的能障（PB）降低，使GABA能神經元興奮性增加；GABA能神經元動作電位間距增加，使神經元在單位時間內發放動作電位的個數增加編碼信號的能力增強。本研究進一步探討了小鼠大腦皮層GABA能神經元動作電位的發育規律，明確了能障與ISI之間的關系，為了解GABA能神經元對輸入信息的編碼機制及發育規律提供一些理論依據。

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作者簡介：

葛榮靖（1982-），女，安徽省蚌埠市人，民 族：漢 職稱：講師，學歷：博士研究生。研究方向：神經信息編碼的細胞與分子機制。

基金項目：安徽省自然科學基金（1608085QH176）；安徽高校省級自然科學研究項目（KJ2012B105）；蚌埠醫學院科學研究重點項目（BYKY1623ZD）.