不同產地普洱生茶中總游離氨基酸含量的區別研究

王石磊，雷文波，余佳慧，饒桂維

(1.浙江樹人大學生物與環境工程學院，浙江杭州 310015;2.麗水海關檢驗檢疫綜合技術服務中心，浙江麗水 323000)

普洱茶是一種深受廣大消費者喜愛的云南特色茶葉品種，它以云南大葉種曬青毛茶為原料，采用特定的加工工藝制成，具有其獨特的品質［1］。廣義的“普洱茶”包括普洱生茶，普洱陳茶和普洱熟茶三大類。普洱生茶是指未經發酵生產的曬青毛茶，既可作為綠茶直接飲用，又可通過自然發酵轉化為普洱陳茶，或通過人工發酵技術快速轉化為普洱熟茶［2］。現代科學研究證實普洱茶具有多種保健功效，尤其是降脂減肥方面效果的報道較多［3］。普洱茶含有黃酮、茶多酚、兒茶素、生物堿、氨基酸、茶色素、有機酸、游離糖、游離氨基酸等大量化學成分［3］。氨基酸作為普洱茶的主要成分之一，對普洱茶品質和內含物質的轉化都有著重要的影響［4］。游離氨基酸是普洱茶品質的重要評判指標之一，茶葉鮮爽與否與其含量密切相關，其參與的化學反應與普洱茶葉香氣物質的形成密切相關［5］。曬青茶作為制作普洱茶的基礎原料，其品質受季節、樹齡、產地等因素影響［6］，為此不同產地出產的普洱生茶中游離氨基酸等物質的含量也存在一定的差異。本文先通過單因素與正交實驗優化了普洱生茶中總游離氨基酸的提取方法，再在最佳提取條件下對瀾滄市、德宏州、西雙版納等6個不同產地的普洱生茶含有的游離氨基酸總量進行了測定。

1 材料與儀器

不同產地的普洱生茶(市售)，磷酸氫二鈉(AR)，磷酸二氫鉀(AR)，茚三酮(含量≥99%)，谷氨酸(含量≥99%)，比色管(具塞)，容量瓶，電子分析天平，可見分光光度計(日本島津UV－124型)。

2 實驗方法

2.1 標準曲線的建立

雖然游離氨基酸測定的國標中規定茶氨酸和谷氨酸均可作為茶葉中游離氨基酸測定的標準物質［7］，但考慮到靈敏度等問題［3］，本實驗選取谷氨酸作為標準品來繪制標準曲線。先配制濃度為10 mg/mL的谷氨酸標準儲備液，稱取250 mg谷氨酸溶于適量水中，轉移定容至25 mL，搖勻。該標準儲備液1 mL含有 10 mg 的谷氨酸。從中準確吸取 0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別加水定容至50mL，搖勻。該系列標準工作液1 mL分別含有 0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg 谷氨酸。

分別吸取1 mL谷氨酸系列標準工作液于一組25 mL比色管中，各加pH值8.0磷酸鹽緩沖液0.5 mL和2%茚三酮溶液0.5 mL，在沸水浴中加熱15min。待冷卻后加水定容至25 mL。放置10min后，以試劑空白溶液作參比，用紫外可見分光光度計測定樣品在570 nm處的吸光度A。將測得的吸光度與對應的谷氨酸濃度的繪制標準曲線，計算回歸方程。

2.2 不同產地普洱茶中干物質含量的測定

準確稱取普洱生茶試樣2 g(精確至0.0001 g)于已知質量的玻璃扁形稱量瓶中，置于103℃士2℃烘箱內(瓶蓋斜支于瓶邊)。干燥4 h后，加蓋取出，置干燥器內冷卻至室溫，稱量(精確至0.0001 g)。再置于烘箱中干燥1 h，加蓋取出，于干燥器內冷卻，稱量(精確至0.0001 g)。重復干燥1h的操作，直至恒重(連續兩次稱重差不超過0.005 g)，以最小質量記為烘干后的質量。計算茶葉水分含量及干物質含量，以質量分數(%)表示，水分含量按下式進行計算:

式中:

m1:試樣和烘皿烘前的質量，單位為克(g);

m2:試樣和烘皿烘后的質量，單位為克(g);

m0:試樣的質量，單位為克(g)。

2.3 普洱生茶中總游離氨基酸的提取工藝優化

2.3.1 提取溫度的確定

選取提取時間為40min，用蒸餾水浸提，料液比為1∶100，分別在20、40、60、80、100℃的提取溫度下提取茶葉中游離氨基酸，測定游離氨基酸得率與提取溫度之間的關系。

2.3.2 提取時間的確定

取提取溫度100℃，料液比為1∶100，用蒸餾水浸提，分別提取 10、20、30、40、50、60min 浸，研究游離氨基酸得率與提取時間的關系。

2.3.3 料液比的確定

選取提取溫度為100℃，提取時間為40min，用蒸餾水浸提，分別在 1∶80、1∶100、1∶120、1∶140、1∶160、1∶180 的料液比下浸提游離氨基酸，研究游離氨基酸得率和液料比之間的關系。

2.3.4 正交實驗

在單因素研究的基礎上，以浸提溫度、浸提時間、料液比3個因素為自變量，3因素3水平建立正交試驗表，根據單因素的結果設計正交試驗并進行實驗。

2.4 不同產地普洱茶中總游離氨基酸含量的測定

分別精確稱取六個不同產地的普洱茶樣品2 g(精確至0.0001 g)，選取正交實驗中確定的最優條件進行游離氨基酸的提取，分別進行三次平行試驗，測試結果取平均值，比較各地普洱茶中的總游離氨基酸的含量區別。

3 結果和分析

3.1 谷氨酸的標準曲線

將測得的吸光度對谷氨酸溶液的濃度進行線性回歸分析，得出回歸方程為 y=2.9971x －0.082，R2=0.9939，表明谷氨酸溶液在0～0.6 mg/L之間與吸光度線性關系良好，實驗結果見圖1。

圖1 谷氨酸濃度與吸光度之間的關系Fig.1 Relationship between the concentration of glutamic acid and the absorbance

3.2 不同產地普洱茶中干物質含量

按2.2中的方法測得不同產地普洱茶中的水分含量和干物質含量，結果如表1所示。

表1 不同產地普洱茶中干物質含量Table1 Dry matter content in pu＇er tea from different areas

3.3 普洱生茶中總游離氨基酸的提取工藝優化

3.3.1 提取溫度對游離氨基酸得率的影響

選取提取時間為40min，用蒸餾水浸提，料液比為1∶100，分別在20、40、60、80、100℃的提取溫度下提取普洱茶中游離氨基酸，測得游離氨基酸含量與提取溫度之間的關系，實驗結果見圖2。

圖2 溫度對浸提游離氨基酸的影響Fig.2 The influence of temperature on the extraction of free amino acids

如圖2可見，隨著溫度的升高，游離氨基酸的得率增加顯著。由于浸提溶液為蒸餾水，蒸餾水的沸點為100℃，為此只能測得在最高實驗溫度100℃時，游離氨基酸得率最高。

3.3.2 提取時間對游離氨基酸得率的影響

取提取溫度100℃，用蒸餾水浸提，料液比為1∶100，分別提取時間 10、20、30、40、50、60min，研究游離氨基酸含量與得率之間的關系，實驗結果見圖3。

圖3 提取時間對茶葉中游離氨基酸得率的影響Fig.3 The influence of time on the extraction of free amino acids

試驗表明，提取時間在40min時，提得的游離氨基酸得率最高，達到了1.99%。繼續延長提取時間，游離氨基酸含量反而下降。因此提取40min為浸提時間的最佳選擇。

3.3.3 料液比對游離氨基酸得率的影響

選取提取溫度為100℃，提取時間為40min，用蒸餾水浸提，分別在 1∶80、1∶100、1∶120、1∶140、1∶160、1∶180 的料液比下浸提游離氨基酸，研究游離氨基酸得率與液料比之間的關系，實驗結果見圖4。

圖4 提取液料比與游離氨基酸得率之間的關系Fig.4 The influence of solid － liquid ratio on the extraction of free amino acids

由圖4可知當液料比低于100∶1時，隨液料比的增加，氨基酸的得率增加，但液料比高于100∶1時，隨著液料比的增加，游離氨基酸的得率反而略有下降，液料比100∶1相對是一個較優的提取條件。

3.3.4 正交實驗

為了進一步優化提取方案，在單因素試驗的基礎上，選擇提取溫度、提取時間、料液比3個對游離氨基酸得率影響較大的因素，設計了3因素3水平的正交實驗，試驗因素水平見表2，正交試驗結果，見表3。

表2 正交試驗設計Table2 Factor level of experiment

表3 正交試驗設計表及結果Table3 Orthogonal experiment chart and result

從表3可知，提取溫度、提取時間和料液比都是普洱茶中游離氨基酸提取的重要影響因素。其中由R值可知，浸提時間是影響普洱茶中游離氨基酸提取得率最大的因素，其次是料液比，最后是提取溫度。根據正交實驗所得出的最佳工藝條件為提取溫度:100℃，提取時間:40min，料液比1∶100。為了驗證實驗結果的可靠性，按照正交實驗得到的最佳工藝條件對德宏州產的普洱生茶平行提取三次，求得游離氨基酸的得率平均值為2.05%，實驗結果具有較好的重現性。

3.4 不同產地普洱茶中游離氨基酸含量的測定

以正交實驗得出的最佳提取條件，對六個不同地區的普洱生茶中的總游離氨基酸含量進行測定，測定結果見表4。由實驗結果可知，臨滄地區的普洱生茶中游離氨基酸的含量相對較高。

表4 不同產地普洱茶中游離氨基酸的含量Table4 Free amino acids content in pu＇er tea from different areas

4 結論

(1)以谷氨酸作為標準物質，在濃度0～0.6 mg/L范圍內與茚三酮反應的產物在570nm波長下與吸光度的線性關系良好。

(2)以蒸餾水作為溶劑，在加熱情況下提取普洱生茶中的游離氨基酸，隨著提取溫度的升高，游離氨基酸的得率不斷提高，在最高提取溫度100℃下有最高的提取率;隨著提取時間的增加，提取得到的游離氨基酸得率先升高再降低，在提取40min后得率最高;隨著液料比的增加，提取得率先升后降，在液料比100∶1的情況下有最高的提取得率。正交實驗表明，提取條件中提取時間是影響最大的因素，其次是液料比，最后才是提取溫度。根據正交實驗所得出的最佳工藝條件為提取溫度:100℃，提取時間:40min，料液比 1∶100。

(3)利用單因素和正交實驗得出的最優提取條件對6個不同產地的普洱生茶進行游離氨基酸含量的測定，不同產地的普洱生茶游離氨基酸含量存在一定的差別，但是差別不算太大，其中臨滄市出產的普洱茶中游離氨基酸含量最高，達到了2.38%。