銀杏雙黃酮類化合物研究進展

馬小芳，楊世龍，唐 穎，周夢怡

(南京林業大學現代分析測試中心，江蘇南京 210037)

銀杏葉中含有豐富的營養成分，主要含有黃酮類、內酯類、多糖類、兒茶素類、聚異戊烯醇、烷基酚及酚酸類、原花青素類、氨基酸類、維生素、脂肪類、有機酸類和微量元素等200多種化合物。銀杏葉提取物(Extract of Ginkgo Biloba Leaf，EGb)是采用一定的工藝將銀杏葉中銀杏黃酮、銀杏內酯等主要活性成分提取出來的產品，具有多種生物活性，應用廣泛。由于銀杏葉中黃酮類化合物含量較高、活性較好，因此，有關黃酮類化合物的研究方興未艾。銀杏黃酮類包括銀杏單黃酮和銀杏雙黃酮，它們都具有許多生物活性，但由于銀杏雙黃酮在銀杏葉中含量較低，研究較困難，所以研究相對較少，但其應用前景較好。

銀杏雙黃酮是由兩分子黃酮母核通過C－C鍵聚合而成的一類化合物，主要有6種，分別為穗花杉雙黃酮、金松雙黃酮、銀杏黃素、異銀杏黃素、白果黃素，5＇－甲氧基白果黃素。主要雙黃酮類化合物結構如圖1所示。

圖1 主要銀杏雙黃酮結構式Fig.1 The structures of biflavonoids in ginkgo leaves

1 銀杏雙黃酮類化合物的提取與純化

早在1929年，Furukawa就從銀杏葉中提取分離得到了雙黃酮類化合物，但由于科技水平限制，直到1941中澤浩一分離出了銀杏黃素，并確定了它的分子式為C32H22O10［1］。到 20 世紀60年代，隨著現代分離分析技術的發展，使人們對銀杏葉的基本成分有了新的更深入的認識。BarKer等人［2］又用萃取、重結晶、逆流分離等方法，從銀杏黃素的混合物內分離出異銀杏黃素和白果黃素兩種雙黃酮。1969年 Miura等人［3］從銀杏葉中首次分離得到金松雙黃酮，1980年，Marc等人［4］從銀杏葉中首次提取得到了5＇－甲氧基白果黃素，1988年，Lobstein等人［5］首次在銀杏葉中得到了穗花杉雙黃酮，1999年，Krauze等人［6］從銀杏葉中分離得到了2，3－二氫金松雙黃酮，2005年，Hyun等人［7］還從銀杏葉中提取得到了銀杏黃素和異銀杏黃素的糖苷。我國對銀杏葉中雙黃酮的研究較晚，1983年，周日秀［8］對廬山銀杏葉中的雙黃酮進行分離鑒定，得到金松雙黃酮和異銀杏雙黃酮。1991年，游松等［9］對銀杏葉中的雙黃酮進行了結構分析;1995年鐘郁青等［10］分離得到銀杏黃素、異銀杏黃素和去甲基銀杏黃素，并采用內標法測定其含量;1999年，王曉葵［11］發現用乙二醇二甲醚提取銀杏葉，提取液中的雙黃酮含量較高，效果比乙醇、甲醇和乙醇－乙醚(1∶1)好，而用乙醇－乙二醇二甲醚(1∶1)混合提取銀杏葉，提取液中雙黃酮含量更高，所得提取物中銀杏雙黃酮的含量達53.89%;2001年唐于平等［12］從銀杏葉中分離得到銀杏黃素、異銀杏黃素和金松雙黃酮;2006年尉小慧等［13］從銀杏葉中分離得到了銀杏黃素、去甲基銀杏黃素和金松雙黃酮，并研究了其對磷酸二酯酶5抑制活活性;2010年，孔繁晟等［14］從銀杏葉中制備的金松雙黃酮可以作為對照品，得到純度為98.5%金松雙黃酮。2012年姚鑫等［15］分析了銀杏落葉的化學成分，經提取、萃取、過柱得到銀杏黃素、異銀杏黃素、金松雙黃酮和白果黃素。

提取銀杏葉中雙黃酮的主要方法是溶劑回流法，所得提取液中往往成分復雜，含有單黃酮、黃酮苷、糖類、鞣質、酸類等多種成分，需要進一步分離純化，需經萃取、過柱、重結晶等分離純化方法得到不同雙黃酮的單體。

1.1 提取溶劑的選擇

與單黃酮和黃酮苷相比，雙黃酮類化合物極性較小，采用極性相對較小的溶劑可以提高雙黃酮的提取率。目前常用于提取雙黃酮的溶劑有95%乙醇、乙醇、甲醇、60%丙酮、丙酮、乙醚、氯仿、乙醇－乙二醇二甲醚(1:1)混合溶劑等。采用加熱、超聲、微波等輔助方法，以此來提高雙黃酮的提取率;采用索式提取等方法可以減少后處理操作，提高效率。

1.2 分離純化

常用來分離純化雙黃酮類化合物的方法有萃取、柱色譜、重結晶等方法，隨著科技的發展，高效逆流分配色譜、制備液相等儀器的出現大大提高了分離效果和工作效率。根據相似相容原理，雙黃酮類化合物易溶于極性較低的化合物，如乙酸乙酯、氯仿等;同時，雙黃酮類含有酚羥基，也易溶于堿性水溶液中，因此，可以采用不同極性的有機溶劑、不同pH的堿性溶液作為萃取劑、洗脫劑或重結晶溶劑，將不同種類的化合物分離，從而得到雙黃酮類化合物。例如，Miura等人［3］將銀杏葉的甲醇提取液旋干，得到甲醇粗體物，先用熱水除去粗體物中水溶性成分，剩下的粗提物用三氯乙烯回流，收集不溶固體，用3%KOH溶液溶解，過濾，酸化，得到的沉淀用50%乙醇溶解，將不容固體乙酰化，再用乙酸乙酯重結晶，得到的晶體用2.5%KOH水解，吡啶－甲醇重結晶，得到雙黃酮混合物，采用逆流分配法得到白果黃素、銀杏黃素、異銀杏黃素和金松雙黃酮。

由上可以看出，銀杏葉中雙黃酮的提取步驟較為繁瑣，但基本操作包括:先采用醇、酮、乙醚等提取，將提取液用堿性水溶液或有機溶劑萃取，將乙酸乙酯或氯仿萃取部分上硅膠柱，采用不同極性的溶劑洗脫，得到雙黃酮粗體物，經重結晶得到雙黃酮化合物單體。

2 銀杏雙黃酮類化合物的生物活性

雙黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等生物活性。

2.1 抗腫瘤活性

Pan等［16］從分子結構上研究了穗花杉類雙黃酮與組織蛋白酶B相互作用，進一步揭示了雙黃酮抑制組織蛋白酶B的機理，有利于進一步了解雙黃酮抗炎、抗腫瘤的機理。研究研究發現銀杏黃素具有抑制卵巢癌的作用，其IC50值為1.8μg·mL－1。穗花杉雙黃酮通過激活hPPARγ來提高抗癌基因的表達，從而達到抑制乳腺癌細胞和宮頸癌細胞的效果［17－18］。Sang等［19］研究發現異銀杏黃素通過抑制HT1080纖維肉瘤細胞中的MMP－9表達來抑制癌細胞的增殖。

2.2 抗氧化活性

潘蘇華等［20］研究發現異銀杏雙黃酮使缺氧大鼠血漿及紅細胞內超氧陰離子含量降低，其作用優于阿司匹林;此外異銀杏雙黃酮能使血清總超氧化物歧化酶(SOD)活性升高。Lee等［21］研究發現，穗花杉雙黃酮可以抑制由紫外輻射引起的金屬蛋白酶的表達，從而起到抗氧化、防輻射的作用。Zhang等［22］研究發現穗花杉雙黃酮和銀杏黃素具有一定的抗氧化活性，去除DPPH自由基的能力較強。Li等研究表明［23］，穗花杉雙黃酮具有抗氧化活性，可有效清除·OH，·O2－，DPPH·，ABTS+·等自由基，并可以保護DNA免受·OH引起的氧化損傷。

2.3 抗炎活性

銀杏雙黃酮類化合物通過抑制磷脂酶A2、促炎基因的表達起到抗炎的作用。Hyun等［24］通過對小鼠模型研究發現銀杏黃素能抑制慢性皮炎，還能抑制表皮增生。Son等［25］研究發現，銀杏黃素通過抑制小鼠骨髓中的環氧合酶－2和5－脂氧合酶來達到治療關節炎的效果，其IC50值為分別為0.75μmol·L－1和 0.33μmol·L－1，同時，銀杏黃素還能抑制細胞脫粒反應，其IC50值為6.52μmol·L－1。Zhou 等［26］采用 SEAP 實驗法得到銀杏黃素和異銀杏黃素能抑制NF－κB因子，從而起到抗炎的作用，且銀杏黃素的抑制作用強于異銀杏黃素，其IC50值為7.5 μmol·L－1。An等［27］的研究表明，穗花杉雙黃酮具有較好的抗炎效果，可以有效抑制因牛皮癬引起的皮膚褶皺增厚和紅疹，其機理是穗花杉雙黃酮通過影響一系列激素而起到抗炎的作用，可以作為治療牛皮癬的藥物。

2.4 抗病毒活性

Lin等［28］體外研究表明穗花杉雙黃酮可以抑制HIV－1病毒，IC50值為119μmol·L－1。Wilsky 等［29］研究表明，穗花杉雙黃酮通過抑制脂肪酸合酶來降低柯薩奇病毒B3的增殖。Ryu等［30］研究發現穗花杉雙黃酮具有較強抑制SARS－CoV3CLpro病毒活性，IC50 值為 8.3μmol·L－1。

2.5 滅菌殺蟲活性

Hwang等［31］研究發現穗花杉雙黃酮能引起白色念珠菌線粒體紊亂，引起細胞凋亡，達到抑菌的效果。Weniger等人［32］研究發現銀杏黃素和異銀杏黃素具有殺滅錐體蟲的活性，IC50值分別為11，13μmol·L－1，此外異銀杏黃素對殺滅利什曼原蟲具有較高的活性，其 IC50值為 1.9μmol·L－1。

2.6 生理調節作用

Saponara等［33］研究發現，雙黃酮類化合物可以抑制cAMP－磷酸二酯酶，其抑制順序為:穗花杉雙黃酮＞白果黃素＞紅杉黃酮＞銀杏黃素=異銀杏黃素，而金松雙黃酮幾乎沒有抑制作用。von Moltke等［34］的研究結果表明，穗花杉雙黃酮可有效抑制細胞色素 P450家族中的 CYP2C9，IC50值為0.019μg·mL－1(0.035 μmol·L－1)。Lee等［35］研究發現穗花杉雙黃酮是過氧化物酶體增殖劑激活受(hPPARγ)激活劑，可以通過調節hPPARγ來調節生物體的新陳代謝，并研究了穗花杉雙黃酮和hPPARγ的結合模型。

2.7 抑制心腦血管疾病

雙黃酮化合物具有調節血糖血脂，防止血栓形成的作用，對中風老年癡呆有一定活性。潘蘇華等［36］研究證明，異銀杏雙黃酮體內給藥，可以抑制腺苷二磷酸(ADP)誘導的血小板聚集，血漿纖維蛋白原含量明顯降低。體外實驗表明，異銀杏雙黃酮對ADP和膠原誘導的血小板聚集均有抑制作用，也能抑制膠原誘導的血小板變形和減慢血小板最大聚集速度，因此異銀杏雙黃酮具有抑制血小板聚集、防止血栓形成的作用。Arjun Thapa等［37］研究表明穗花杉雙黃酮可以阻止β－淀粉狀蛋白聚合，防止老年癡呆癥的發生，且雙黃酮類化合物的活性強于單黃酮。

2.8 其他作用

此外雙黃酮化合物還具有保護神經系統、促進骨骼發育等作用。Kang等［38］研究發現穗花杉雙黃酮、銀杏黃素和異銀杏黃素對氧化和β－淀粉狀蛋白引起的神經細胞損傷具有較強的抑制作用，起到保護神經系統的作用，具有治療中風、老年癡呆等神經疾病的潛力。Ishola等［39］研究表明穗花杉雙黃酮具有抗抑郁、抗焦慮的作用，可改善小鼠的精神狀態。Lee等［40］通過研究小鼠骨細胞中堿性磷酸酶活性、膠原合成和礦化程度發現白果黃素和金松雙黃酮具有促進骨細胞分化的作用，有望應用于治療相關骨骼疾病。Prasad等［41］發現穗花杉雙黃酮具有在體內降低油脂的活性，有望用來治療高血脂等由脂肪過多引起的疾病。

3 展望

銀杏雙黃酮類化合物具有多種生物活性，且部分生物活性強于單黃酮，是一類具有開發應用前景的化合物。雙黃酮類化合物在天然產物中來源少，開展雙黃酮類化合物的全合成工作很有意義;此外可以對天然雙黃酮類化合物進行改性，以提高其生物活性，更好的應用于醫療保健。研究銀杏雙黃酮不僅進一步利用銀杏葉資源，更可以造福于人類。