毛細管電泳對水體中多類抗生素的同時分離檢測*

譚 韜，劉應杰，唐 倩，鐘文武，蘭作平

(1.重慶醫藥高等專科學校 401331；2.重慶市藥物制劑工程技術研究中心 401331)

有報道表明，我國地表水中測出了60余種抗生素[1]，其濃度水平與檢出頻率均高于其他國家。殘留抗生素源于生活污水、畜牧養殖廢水及糞渣[2]、制藥廠[3]和醫院廢水[4-5]的排放，使得水環境維持低水平抗生素，對水生生物造成遠期毒性作用，并使水中微生物群落產生耐藥性[6]。自然水體中殘留抗生素多為“ng/L”至“μg/L”級別[7]計算，常用固相萃取-高效液相色譜法(SPE-HPLC)[8]、固相萃取-高效相色譜-串聯質譜法(SPE-HPLC-MS/MS)[9]等方案進行富集、分離，但存在預處理耗時、昂貴等問題。雖毛細管電泳在靈敏度和重現性略輸于HPLC[10]，但因其具備抗樣品基質干擾能力強、樣品預處理簡單等優點，已廣泛應用于抗生素的分離檢測[11-13]。有報道稱，中國地表水環境中抗生素檢出頻率較多的種類有磺胺類(SAs)、喹諾酮類(FQs)、四環素類(TCs)等[1]，因此，建立一種同時對自然水體中多類殘留抗生素的分離檢測方案，對于殘留抗生素的快速、全面監控顯得十分必要。

本研究經綜合對比后,采用了毛細管電泳法中最為穩定的區帶電泳技術，用紫外檢測器，對緩沖液種類、pH、分離電壓及進樣方式等電泳條件進行了摸索和優化，實現了自然水體中諾氟沙星(NOR)、氧氟沙星(OFL)、四環素(TC)、土霉素(OTC)、磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺甲噁唑(SMZ)等3類6種抗生素的同時分離檢測,探討了緩沖溶液種類對分離、分析的影響。

1 材料與方法

1.1材料 CL 1020高效毛細管電泳儀(配CL 101C型±30 kV可調高壓電源、紫外檢測器、HW-2000色譜工作站，北京彩陸儀器有限公司，中科院研究生院應化所，中國)；熔融石英毛細管柱65 cm×75 μm ，有效長度55 cm(河北永年銳灃色譜器件有限公司，中國)；Orion828型pH儀(奧立龍公司，美國)；GWA-UN1型超純水器(北京普析通用儀器有限公司，中國)；Discovery DV215CD十萬分電子天平(奧豪斯公司，美國)。NOR、OFL、TC、OTC、SDZ、SMZ均為美國Sigma公司產品，純度大于0.98；四硼酸鈉(Na2B4O7，分析純，重慶博藝化學試劑有限公司，中國)；磷酸二氫鉀(KH2PO4分析純，西安化學試劑廠，中國)；磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫鈉(Na2HPO4)、磷酸鈉(Na3PO4)、檸檬酸、檸檬酸鈉等其余試劑的純度均為分析純；自然水體采自嘉陵江石門大橋段。

1.2方法

1.2.1緩沖溶液的制備 精密稱取Na2B4O7、KH2PO4、NaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4、檸檬酸、檸檬酸鈉適量，分別用超純水溶解制成0.05、0.2、0.2、0.2、0.2、0.2、0.2 mol/L貯備液。根據種類和濃度需要配制運行緩沖溶液，若需調節緩沖溶液pH時，則通過滴加1 mol/L NaOH及磷酸(H3PO4)溶液調節，用pH計精密測量。緩沖溶液使用前用0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.2.2對照品貯備液的制備 精密稱取NOR、OFL、TC、OTC、SDZ、SMZ對照品適量，用超純水(已用5 mol/L HCl調節pH至3.0左右)分別稀釋制成2.0 mg/mL對照品貯備液。

1.2.3供試品溶液的制備 精密稱取NOR、OFL、TC、OTC、SDZ、SMZ對照品適量，用自然水(已用5 mol/L HCl調節pH至3.0左右)分別稀釋制成1.0、2.0、2.0、3.0、1.0、1.0 mg/mL的樣品貯備液。分別精密量取上述樣品貯備液各1 mL于50 mL容量瓶中，加自然水30 mL，用測試用緩沖溶液定容至刻線，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾即得。臨用前配制，超聲處理10 min。

1.2.4電泳條件

1.2.4.1毛細管的處理 毛細管使用前，按順序用超純水、甲醇、超純水沖洗20、20、3 min，再分別用1 mol/L NaOH活化10 min、0.1 mol/L NaOH活化40 min，最后用超純水、緩沖溶液分別沖洗5、10 min即可。每次進樣前都應分別用0.1 mol/L NaOH沖洗5 min，超純水沖洗3 min，緩沖溶液沖洗5 min。

1.2.4.2優化電泳條件 電動進樣25 kV×10 s，分離電壓22 kV，操作溫度20～22 ℃，優化緩沖溶液為20 mmol/L Na2B4O7+10 mmol/L KH2PO4(pH=8.60)，檢測波長確定為260 nm。取1.2.3項下供試溶液實驗，其分離結果見圖1。

圖1 最優電泳條件下的供試溶液毛細管電泳圖

2 結 果

2.1毛細管電泳分離條件優化

2.1.1檢測波長的選擇 《中國藥典》2015年版記載，SMZ及其制劑定量檢測多采用240與254 nm，SDZ及其制劑定量檢測多采用260 nm，NOR及其制劑定量檢測多采用255～280 nm，OFL及其制劑定量檢測多采用290 nm，TC及其制劑定量檢測多采用280 nm、OTC及其制劑定量檢測多采用280 nm進行檢測。為保證待測物質均有較大吸收,本方法采用260 nm為檢測波長。

2.1.2進樣方法的選擇 毛細管電泳的進樣方法常有壓力進樣和電動進樣兩種方式。相對于樣品無差別進樣的壓力進樣方式，電動進樣對樣品中目標檢測品有一定的選擇性。當采用壓力進樣，自然水體中存在的泥沙膠體、腐殖質等小粒徑懸浮物也進入進樣端，使得檢測時基線不穩、毛刺增多，干擾嚴重。本方法采用了正極端進樣，在電動進樣方式下，自然水體中的懸浮顆粒受電場影響，進入進樣端的量大大降低，可使基線噪聲降低、色譜峰峰形變好，能達到在線樣品凈化效果，降低干擾，提高檢測靈敏度和準確度。因此,本方法選擇了電動進樣方式。

2.1.3緩沖溶液種類、濃度及pH的優化

2.1.3.1緩沖溶液種類的選擇 在采用了Na2B4O7-KH2PO4、Na2B4O7-NaH2PO4、Na2B4O7-Na2HPO4、Na3PO4-NaH2PO4、Na3PO4-Na2HPO4、檸檬酸鈉-檸檬酸等緩沖溶液體系后，本方案最終選擇了Na2B4O7-KH2PO4體系。本研究發現，緩沖溶液種類對毛細管區帶電泳的分離效率影響極大，甚至大過緩沖溶液pH的影響。在pH為8.6時，分別以Na2B4O7-KH2PO4、Na2B4O7-NaH2PO4、Na3PO4-NaH2PO4體系為緩沖溶液，并保持近似的緩沖溶液離子強度。結果表明，硼砂體系的分離效率明顯優于磷酸鈉鹽體系，磷酸鉀鹽體系優于磷酸鈉鹽體系，如圖1、2所示。因此最終選擇Na2B4O7-KH2PO4體系為緩沖液。

A:20 mmol/L Na2B4O7+15 mmol/L NaH2PO4;B:20 mmol/L Na3PO4+15 mmol/L NaH2PO4

2.1.3.2緩沖溶液濃度的優化 隨著緩沖液Na2B4O7-KH2PO4濃度的增加，樣品的出峰時間逐漸推后，并且基線噪音逐漸增大，提示這與緩沖溶液離子強度變大，運行體系電流增加有關系。優化后的緩沖溶液濃度為20 mmol/L Na2B4O7+10 mmol/L KH2PO4。

2.1.3.3緩沖溶液pH的優化 本方法考察了不同pH對組分遷移時間和分離效率的影響,見圖3。最終確認緩沖液優化pH為8.60。

圖3 20 mmol/L Na2B4O7-10 mmol/L KH2PO4緩沖溶液不同pH對遷移時間的影響

2.1.4分離電壓的優化 在分離電壓大于25 kV時，SDZ和SMZ、NOR和OFL無法實現良好分離，且毛刺明顯增多；分離電壓小于18 kV時分離時間超過50 min，組分自然擴散加劇，峰展寬嚴重。最終的分離電壓確定為22 kV。

2.2方法學驗證

2.2.1重現性試驗 取1.2.2對照品貯備液，按“1.2.4”項下電泳優化條件連續進樣測定5次，考察各組分峰面積和遷移時間的相對平均偏差(RSD)。6種抗生素峰面積的RSD為2.5%～4.7%，遷移時間的RSD為0.31%～0.48%，重現性良好，見表1。

2.2.2線性范圍 在優化條件下，配制6組不同濃度的6種抗生素的混合標準溶液，各濃度重復進樣3次，以峰面積的平均值計算線性方程和相關系數，結果見表1。可見，0.5～40.0 mg/L范圍內6種抗生素的線性相關系數大于0.988，線性關系良好。

2.2.3檢出限 如表1所示，在優化條件下，根據6種抗生素各為0.5 mg/L的供試溶液的峰高及基線噪音，以信噪比(S/N)≈3計算，6種抗生素的檢出限在0.08～0.55 mg/L。

表1 毛細管電泳重現性驗證

2.2.4回收率試驗 按優化條件，以自然水體為基質，對按“1.2.3”配制的供試溶液中6種抗生素進行了50，100和200 μg/L水平的加標回收率實驗，在每個濃度水平進行5次平行測定，得到的加標回收率見表2，數據表明本文所建立的分析方法可靠性較高。

表2 加標樣品回收率(n=5)

續表2 加標樣品回收率(n=5)

3 討 論

本研究建立了水體中3類6種抗生素的分析方法，考察了緩沖溶液類型、pH、進樣方式、分離電壓等因素對6種抗生素分離效果的影響。本研究發現緩沖溶液種類的選擇對毛細管區帶電泳的分離效率影響極大，本方法最終選擇了Na2B4O7-KH2PO4體系作為緩沖溶液。已知SMZ的pK=5.69[14]，SDZ的pK=6.36[14]；NOR的pK1和pK2分別為6.18和8.60[15]，OFL的pK1和pK2分別為6.20和8.20[15]；TC的pK1、pK2、pK3分別為3.2、7.5、8.9[12]，OTC的pK1、pK2、pK3分別為3.3、7.8、9.6[12]。根據各組分pK可知，在pH為6～7的供試品溶液中，各組分應略帶正電荷；而自然水體中存在大量的泥沙膠體、腐殖質等粒徑小于100 nm的懸浮粒主要帶負電荷[16]。基于待測組分和懸浮顆粒電荷的區別，本研究組采用了電動進樣方式以正極端進樣。在進樣時懸浮顆粒受電場的影響，進入進樣端的量大大降低，降低了水體中帶電懸浮顆粒對分離的干擾，實現了在線的樣品凈化，使得檢測的穩定性、準確度和靈敏度大幅提高。

本方法樣品預處理簡單，分析時間短，具有明顯優勢，能夠滿足自然水環境中殘留抗生素的檢測要求，為水環境中殘留抗生素的監測提供了一種簡單可行的方案。