肝泡型包蟲病患者體液免疫變化的研究*

馬 婕,冀林華,劉文靜,崔 森△,樊海寧▲

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院,西寧 810001;2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心,西寧 810001)

包蟲病是常見的人畜共患病，是由棘球絳蟲幼蟲-棘球蚴寄生而致的，又稱棘球蚴病。引起人感染的主要是細(xì)粒棘球蚴和多房棘球蚴，又分別稱為囊型(cystic echinococcosis，CE)和泡型包蟲病(alveolar echinococcosis，AE)[1-2]。人體在感染棘球蚴過程中宿主-寄生蟲之間的相互作用關(guān)系十分復(fù)雜[3]。目前對棘球蚴與宿主的免疫反應(yīng)有許多研究結(jié)果，但大多集中在細(xì)胞免疫方面，而對體液免疫的研究還比較少。寄生蟲在宿主體內(nèi)生長離不開體液免疫的調(diào)節(jié)，B細(xì)胞作為機(jī)體體液免疫的重要細(xì)胞，通過提呈抗原、產(chǎn)生抗體以及分泌細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)其價(jià)值[4-5]。本文通過研究肝泡型包蟲病(HAE)患者外周血B淋巴細(xì)胞部分表面抗原的表達(dá)及所分泌的抗體水平變化，探討HAE患者體液免疫的變化情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取30例2015年12月至2016年12月在青海大學(xué)附屬醫(yī)院影像中心初步診斷但未治療的HAE患者(HAE組)，男17例，女13例，平均年齡41.5歲(18～69歲)，回顧手術(shù)后確診為HAE患者。排除標(biāo)準(zhǔn)[6]：(1)感染性疾病(細(xì)菌、病毒等)；(2)惡性腫瘤；(3)風(fēng)濕免疫性疾病患者；(4)合并囊型包蟲病及其他寄生蟲疾病患者；(5)應(yīng)用非甾體類抗炎藥、激素類藥物、精神病治療藥物等。同時(shí)選取30例本院體檢的健康人為正常對照組，其中男16例，女14例，平均年齡42.5歲(19～65歲)，行血常規(guī)、肝腎功能、心電圖及B超等檢查示均正常。本研究經(jīng)青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，抽血及化驗(yàn)均征得受試者同意并簽署知情同意書。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1儀器與試劑 流式抗體CD19-FITC、CD20-PE均購自美國BD公司，10×紅細(xì)胞裂解液購自中國聯(lián)科生物公司，IgG、IgM、IgA均購自美國Thermo Fisher公司，流式細(xì)胞購自艾森生物公司，蛋白分析儀購自德國西門子公司，純水制備系統(tǒng)購自美國Millipore公司，電子天平購自美國Bio-Rad公司，渦旋混合儀購自美國Scientific Industries公司。標(biāo)記筆、采血管、試管、各種規(guī)格的移液器及槍頭等。

1.2.2主要溶液配制方法 (1)1×紅細(xì)胞裂解液：用純水900 mL溶解100 mL 10×紅細(xì)胞裂解液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?2)PBS溶液：將PBS粉末緩沖體系充分溶于超純水，配制成1×PBS緩沖液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測B淋巴細(xì)胞抗原表達(dá) 取100 μL EDTA抗凝全血加入流式細(xì)胞分析專用試管，加入10 μL CD19-FITC、10 μL CD20-PE后混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，再加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，室溫避光反應(yīng)10 min后，離心棄上清液，加入2 mL 1×PBS洗滌1次后以300 μL PBS重懸細(xì)胞，用艾森生物ACEA NovoCyteTM流式細(xì)胞儀進(jìn)行FCM測定，在FSC/SSC圖上設(shè)門去除碎片及死細(xì)胞，然后測定CD19+、CD20+B淋巴細(xì)胞的百分率，用NovoExpress軟件獲取、分析數(shù)據(jù)。

1.2.4檢測IgG、IgM、IgA 抽取外周血2～3 mL于含纖維蛋白酶促凝劑的管中(橘黃色管蓋)，應(yīng)用西門子BNⅡ全自動特定蛋白分析儀檢測IgG、IgM、IgA的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血B淋巴細(xì)胞的比率 HAE組患者外周血CD19+B淋巴細(xì)胞比率為(2.18±0.82)%，正常對照組為(9.26±3.40)%，二者比較HAE組顯著低于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 CD20+B淋巴細(xì)胞比率為(2.88±1.05)%，正常對照組為(4.54±1.26)%，二者比較HAE組顯著低于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1、2。

A：設(shè)門于淋巴細(xì)胞；B：HAE患者外周血CD19+B淋巴細(xì)胞比率；C：HAE患者外周血CD20+細(xì)胞B淋巴比率

A：設(shè)門于淋巴細(xì)胞；B：正常對照組外周血CD19+B淋巴細(xì)胞比率；C：正常對照組外周血CD20+B淋巴細(xì)胞比率

2.2HAE組與正常對照組免疫球蛋白水平比較 HAE組IgG為(23.99±7.08)g/L，IgA為(3.23±1.68)g/L，正常對照組IgG為(11.13±2.30)g/L，IgA為(2.14±1.02)g/L，二組相比HAE組IgG、IgA水平均明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而HAE組IgM為(1.26±0.36)g/L，正常對照組為(1.78±0.80)g/L，二者相比HAE組IgM水平低于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 HAE組與正常對照組免疫球蛋白水平比較

3 討 論

包蟲病被認(rèn)為是一種世界性公共衛(wèi)生問題，在我國以新疆、內(nèi)蒙古、青海等畜牧業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)多發(fā)，嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)發(fā)展及居民健康[7]。包蟲病在人類的傳播過程中，人作為中間宿主，誤食了被狗或狐貍等宿主的糞便排出的寄生蟲卵污染的蔬菜或水源，蟲卵在人小腸內(nèi)孵化并鉆入腸壁，隨血流到達(dá)肝、肺、腦等臟器并寄生，其中以在肝臟內(nèi)寄生最為多見，稱為HEA，在青海地區(qū)HEA較其他地區(qū)多見[8]。

在人體被泡球蚴感染后寄生蟲長期在宿主體內(nèi)寄生，能刺激宿主免疫系統(tǒng)發(fā)生特殊的變化，棘球絳蟲長期寄生于宿主體內(nèi)，為了抵抗宿主免疫系統(tǒng)的殺傷，包蟲能引起宿主免疫系統(tǒng)發(fā)生一系列免疫反應(yīng)，宿主和包蟲的免疫系統(tǒng)都做出了相應(yīng)調(diào)整才能達(dá)到動態(tài)平衡的“共生”狀態(tài)。在泡球蚴感染的早期，為了避免自身遭受傷害，宿主通過體內(nèi)免疫細(xì)胞的增殖及分化使淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能增強(qiáng)，有排除異己、控制泡球蚴早期生長和轉(zhuǎn)移的作用；而隨著病程的進(jìn)展，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能有所下降，宿主的免疫反應(yīng)受抑制，泡球蚴在體內(nèi)長期寄生并發(fā)育[9]。

既往的研究中，細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(INF-γ)等在肝包蟲病免疫中的作用得到闡明，這些細(xì)胞因子對肝包蟲病的發(fā)病機(jī)制及對疾病的嚴(yán)重程度、療效及預(yù)后有重要意義[10]。目前還沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于人體感染包蟲后抗體反應(yīng)的結(jié)論性信息，包蟲感染能引起人體外周血循環(huán)中IgG、IgM、IgA和IgE的變化，有學(xué)者指出肝包蟲病患者免疫球蛋白水平變化結(jié)合超聲影像學(xué)表現(xiàn)，對后續(xù)診斷及治療工作有一定的幫助[11]。

本試驗(yàn)對HAE患者的體液免疫進(jìn)行了研究，比較了HEA患者外周血成熟B細(xì)胞變化及血清IgG、IgA、IgM等抗體的水平與健康人的區(qū)別。以CD19+、CD20+標(biāo)記外周血成熟B細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀測定外周血中CD19+、CD20+表達(dá)量，結(jié)果表明HAE患者CD19+、CD20+陽性率明顯低于正常對照組，說明泡球蚴在體內(nèi)寄生過程中，淋巴細(xì)胞比例下降，宿主的免疫反應(yīng)處于抑制狀態(tài)，使得泡球蚴能在宿主內(nèi)長期寄生并發(fā)育。

寄生蟲侵入宿主機(jī)體后首先表現(xiàn)IgM上升，IgM是一種大分子抗體，相對分子質(zhì)量最大，故稱之為巨球蛋白，IgM能清除血流中的原蟲顆粒，為一種凝集性抗體，是直接、間接凝集實(shí)驗(yàn)的診斷要素。張永紅等[12]在小鼠腹腔接種棘球蚴原頭節(jié)后，在未發(fā)育形成囊泡前30 d能測到低效價(jià)的IgM血清抗體，90 d后隨著囊泡不斷長大，IgM開始降低。本研究中HAE患者血清IgM抗體較正常對照組降低，考慮包蟲在宿主體內(nèi)長期寄生，宿主的免疫抑制，導(dǎo)致IgM下降。

繼IgM后，IgG水平明顯升高，IgG是一種保護(hù)性抗體，在免疫過程中占主導(dǎo)地位，可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合，中和蟲體毒素，對蟲體起殺傷作用。寄生于不同組織器官的包蟲誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗體的類型也不同，表現(xiàn)為肝包蟲的主要是IgG抗體，肺包蟲主要是IgM抗體[13]。IgG包括4種不同類型，分別為IgG1～4，既往研究表明隨著疾病進(jìn)展，IgG1和IgG3水平逐漸降低，而IgG2和IgG4在整個(gè)疾病過程中均保持著類似的高度[14]。IgA存在兩種形式——血清型IgA和分泌性IgA，血清型IgA具有抗蟲體毒素的作用；分泌性IgA在保護(hù)機(jī)體胃腸道、呼吸道等黏膜免疫器官受蟲體入侵時(shí)起到關(guān)鍵作用。GUO等[15]研究發(fā)現(xiàn)IL-6能促進(jìn)IgA的分泌，而近年來研究資料表明，肝包蟲病患者血清IL-6水平較健康人明顯升高，可能是倒導(dǎo)致IgA水平增高的原因之一。

在本研究中HAE患者血清IgM抗體較正常對照組降低，而IgG和IgA則較正常對照組明顯升高，考慮包蟲在宿主體內(nèi)長期寄生的過程中刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)弱不等的免疫應(yīng)答反應(yīng)，隨著包蟲囊增大和包蟲寄生數(shù)量的增多，抗體陽性率也隨之變化[16]。在人體感染包蟲后發(fā)生的免疫反應(yīng)與疾病的性質(zhì)和特點(diǎn)相關(guān)，這個(gè)特性提供了一個(gè)重要的優(yōu)勢，使得免疫系統(tǒng)針對特定群體的傳染病病原體能夠調(diào)整其防御策略。

目前，盡管HAE進(jìn)展的分子機(jī)制尚不明確，但有大量基礎(chǔ)研究結(jié)果顯示體液免疫及細(xì)胞免疫參與其進(jìn)展。HAE的免疫相當(dāng)復(fù)雜，只有清楚地了解了其免疫機(jī)制，才能更有效地尋找抑制包蟲感染的辦法，從而控制其傳播。