喉癌癌組織Survivin基因表達(dá)水平與凋亡相關(guān)因子水平的關(guān)系*

牟基偉，張美佳，吳 建

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科,黑龍江佳木斯 154003)

喉癌是頭頸部常見惡性腫瘤，指發(fā)生在喉部的惡性腫瘤，以鱗狀細(xì)胞癌最為常見，其發(fā)生機(jī)制目前尚不明確，可能與吸煙、飲酒、大氣污染、病毒感染、放射損傷、接觸有毒化學(xué)物質(zhì)等相關(guān)[1-3]。隨著癌基因研究的深入，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)喉癌發(fā)生與凋亡相關(guān)基因失活等存在緊密聯(lián)系，Survivin是近年來新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族成分，可以抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，參與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展[4-5]。目前針對(duì)喉癌癌組織Survivin基因表達(dá)與凋亡相關(guān)因子水平研究較少，因此本文選取佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院2013年1月至2018年1月126例喉癌患者手術(shù)切除的癌組織石蠟標(biāo)本為研究對(duì)象，探討Survivin基因表達(dá)水平與bcl-2、p53、caspase-3等凋亡相關(guān)因子的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 材料取自佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院2013年1月至2018年1月126例喉癌患者手術(shù)切除的癌組織石蠟標(biāo)本，均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌，所有患者術(shù)前均未接受放化療。其中男77例，女51例，年齡37～69歲，平均(53.54±9.64)歲；腫瘤部位：聲門上型53例，聲門型43例，聲門下型30例；TNM分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期38例，Ⅲ期54例，Ⅳ期20例；分化程度：高分化64例，中分化38例，低分化24例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性30例，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性96例。另選取100例聲帶息肉標(biāo)本，病理證實(shí)為炎癥或正常黏膜組織。本研究獲得黑龍江省佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 切片常規(guī)脫蠟，蒸餾水洗滌2～3次，經(jīng)微波抗原熱修復(fù)后，采用免疫組織化學(xué)法檢測Survivin、bcl-2、p53、caspase-3蛋白表達(dá)，用已知陰性組織作為陰性對(duì)照，用已知胃癌陽性片作為陽性對(duì)照，試劑盒購自上海研卉生物科技有限公司，具體操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。在高倍鏡下選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，記錄染色細(xì)胞百分比，Survivin主要在細(xì)胞質(zhì)中著色，bcl-2主要在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中著色，p53主要在細(xì)胞核中著色，caspase-3主要在細(xì)胞質(zhì)中著色，采用Sinicrope改良法判斷Survivin、bcl-2、p53、caspase-3蛋白陽性，染色細(xì)胞小于5%為陰性，染色細(xì)胞大于或等于5%為陽性。染色結(jié)果由2名病理科專家進(jìn)行雙盲判定，意見不統(tǒng)一時(shí)商討后達(dá)成一致。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測Survivin、bcl-2、p53、caspase-3表達(dá)量，試劑盒由武漢華美生物工程有限公司提供，具體操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1Survivin基因表達(dá)與喉癌患者臨床病理特征的關(guān)系 126例喉癌癌組織標(biāo)本中共檢出Survivin陽性86例，陽性率為68.3%(86/126)。Survivin陽性組年齡、性別、腫瘤部位與Survivin陰性組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者比例顯著高于Survivin陰性組(P<0.05)，見表1。

表1 Survivin基因表達(dá)與喉癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

續(xù)表1 Survivin基因表達(dá)與喉癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.2喉癌癌組織與聲帶息肉中Survivin、bcl-2、p53、caspase-3陽性率比較 喉癌癌組織Survivin、bcl-2、p53陽性率顯著高于聲帶息肉(P<0.05)，caspase-3陽性率顯著低于聲帶息肉(P<0.05)，見圖1、表2。

A：Survivin陽性，染色部位在細(xì)胞漿；B:bcl-2陽性，染色部位在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜；C:p53陽性，染色部位在細(xì)胞核；D:caspase-3陽性，染色部位在細(xì)胞漿

表2 喉癌癌組織與聲帶息肉中Survivin、bcl-2、p53、caspase-3陽性率比較[n(%)]

2.3喉癌癌組織Survivin基因表達(dá)與bcl-2、p53、caspase-3的關(guān)系 經(jīng)Spearson相關(guān)性分析，喉癌癌組織Survivin表達(dá)與bcl-2、p53表達(dá)呈正相關(guān)，與caspase-3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，見表3。

2.4喉癌癌組織與聲帶息肉中Survivin、bcl-2、p53、caspase-3表達(dá)量比較 喉癌癌組織Survivin、bcl-2、p53表達(dá)量顯著高于聲帶息肉(P<0.05)，caspase-3表達(dá)量顯著低于聲帶息肉(P<0.05)，見表4。

2.5喉癌癌組織Survivin表達(dá)量與bcl-2、p53、caspase-3的關(guān)系 經(jīng)Spearson相關(guān)性分析，喉癌癌組織Survivin表達(dá)量與bcl-2、p53呈正相關(guān)(r=0.385、0.407，P<0.05)，與caspase-3呈負(fù)相關(guān)(r=-0.471，P<0.05)。

表3 喉癌癌組織Survivin基因表達(dá)與bcl-2、p53、caspase-3的關(guān)系(n)

表4 喉癌癌組織與聲帶息肉中Survivin、bcl-2、p53、caspase-3表達(dá)量比較

3 討 論

腫瘤是一類細(xì)胞周期疾病，經(jīng)歷多基因、多步驟突變，細(xì)胞呈失控性生長，其中細(xì)胞凋亡失衡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制[6-7]。凋亡抑制蛋白家族是一類抑制凋亡的調(diào)節(jié)因子，Survivin是上世紀(jì)九十年代末發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族新成員，定位于人類染色體17q25，由142個(gè)氨基酸組成，只表達(dá)于腫瘤與胚胎組織，與其他凋亡抑制蛋白家族成員比較，Survivin結(jié)構(gòu)簡單，具有其他成員無可比擬的抗凋亡能力。近年來研究顯示，在肺癌、喉癌、胃癌、結(jié)直腸癌、鼻咽癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤均可發(fā)現(xiàn)Survivin過表達(dá)，Survivin已成為腫瘤診斷與治療的新靶點(diǎn)[8-10]。

本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測喉癌癌組織中Survivin基因，Survivin陽性率為68.3%，與以往研究結(jié)果相似[11-12]。喉癌癌組織Survivin陽性患者TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與Survivin陰性患者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著腫瘤進(jìn)展，Survivin表達(dá)增強(qiáng)，抑制異常突變細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞分裂得以繼續(xù)，加快喉癌發(fā)展，增加癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞凋亡過程受細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子與凋亡抑制因子共同影響。Survivin可作為喉癌臨床病理指標(biāo)，對(duì)喉癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移具有一定診斷與預(yù)測價(jià)值。本研究顯示，喉癌組織Survivin、bcl-2、p53陽性率顯著高于聲帶息肉，caspase-3陽性率顯著低于聲帶息肉，提示Survivin及bcl-2、p53、caspase-3等凋亡相關(guān)因子與喉癌發(fā)生、發(fā)展存在一定聯(lián)系。bcl-2是一種細(xì)胞凋亡的拮抗基因，在人體內(nèi)以二聚體形式發(fā)揮作用，可以延長細(xì)胞生命周期，使受損細(xì)胞對(duì)凋亡刺激因素產(chǎn)生耐受性，從而延長細(xì)胞壽命[13-14]。本研究顯示，喉癌癌組織Survivin表達(dá)與bcl-2表達(dá)呈正相關(guān)，可能由于Survivin基因所在染色體不穩(wěn)定，導(dǎo)致bcl-2基因轉(zhuǎn)錄激活，二者協(xié)同發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)。p53是一種腫瘤抑制基因，定位與人類染色體p13，由391個(gè)氨基酸組成，可以使細(xì)胞分裂終止于復(fù)制前期與合成期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，修復(fù)DNA損傷[15-16]。自然型p53半衰期短，免疫組織化學(xué)難以檢出，本研究所檢測到的p53為突變型p53。p53發(fā)生基因突變時(shí)，自然型p53功能喪失活性，促使細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化，并積聚于細(xì)胞內(nèi)，延長半衰期，使免疫組織化學(xué)法可以有效檢測。本研究顯示，喉癌癌組織Survivin表達(dá)與p53表達(dá)呈正相關(guān)，可能與喉癌發(fā)生后自然型p53失活相關(guān)。caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中一種重要效應(yīng)因子，以酶原形式存在，對(duì)細(xì)胞死亡刺激發(fā)生應(yīng)答而被激活，使多種與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白失活，促使細(xì)胞失活[17]。相關(guān)研究顯示，腫瘤組織內(nèi)的caspase-3表達(dá)量顯著低于正常組織[18]。本研究顯示，喉癌癌組織Survivin表達(dá)與caspase-3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，主要由于Survivin對(duì)caspase-3活化形式具有抑制作用，阻止其自然激活，并與caspase-3特異性結(jié)合，造成其活性喪失，抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，Survivin基因表達(dá)與喉癌病情進(jìn)展存在一定聯(lián)系，可作為喉癌預(yù)后指標(biāo)。Survivin基因表達(dá)與bcl-2、p53表達(dá)呈正相關(guān)，與caspase-3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，可通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子，促進(jìn)腫瘤發(fā)展。