HPV DNA實時熒光定量PCR檢測與宮頸癌相關(guān)性研究

程躍建

(江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院檢驗科 224001)

宮頸癌一般可定義為發(fā)生在女性子宮的惡性腫瘤，是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其中大多數(shù)發(fā)生在發(fā)展中國家。近年來，我國宮頸癌的發(fā)病率有所增長，現(xiàn)階段在我國農(nóng)村地區(qū)增長更明顯。為了降低宮頸癌的發(fā)病率，目前對于發(fā)生原因及機制的研究越來越多，2008年，德國科學家Harald zur Hausen因研究人乳頭瘤病毒(HPV)與宮頸癌的關(guān)系而獲得諾貝爾獎。隨著研究深入，宮頸癌的病因越發(fā)趨于明確，這些研究成果為早期發(fā)現(xiàn)、診斷宮頸癌及早日研究宮頸癌的治療策略提供了大量研究資料及理論依據(jù)[1-2]。某些性傳播因素，如性病病毒與宮頸癌發(fā)生的關(guān)系越來越受到國內(nèi)外專家學者的重視。這些病毒中，研究最多的是HPV。根據(jù)導致疾病的危險性不同，可將HPV分為高危型和低危型。低危型HPV對于疾病的產(chǎn)生危險性較低，高危型HPV對于疾病的產(chǎn)生危險性較高。低危型HPV往往引起性疾病，癌變的可能性很小；高危型HPV導致癌變的可能性較大，其中某些類型可能和宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。有研究顯示，高危型HPV能編碼癌蛋白，癌蛋白可能會導致子宮頸上皮瘤樣病變及子宮Ⅱ、Ⅲ級病變，甚至導致宮頸癌的發(fā)生[3-4]。流行病學調(diào)查及實驗室研究結(jié)果顯示，HPV 16和18型與生殖系統(tǒng)惡性腫瘤(如宮頸癌)有明顯相關(guān)性[5-6]。目前HPV DNA實驗室檢測方法很多，常規(guī)聚合酶鏈反應(PCR)具有簡潔、迅速、敏感度高等優(yōu)點，但有無法定量、容易污染，從而導致檢測結(jié)果假陽性等缺點。因此，為了提高檢測結(jié)果的靈敏度、靈活性和準確性，需要較為準確、靈敏和簡便的監(jiān)測方法[7-8]，因此，實時熒光定量PCR應運而生。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013-2016年本院婦產(chǎn)科住院的宮頸癌、宮頸糜爛患者及宮頸組織正常者共125例，所有標本均經(jīng)組織活檢確診，并采集宮頸組織。其中宮頸癌患者(宮頸癌組)60例，年齡18～64歲，平均43.40歲；宮頸糜爛患者(宮頸糜爛組)35例，年齡21～59歲，平均41.30歲；宮頸組織正常者(宮頸正常組)30例，年齡18～58年，平均39.75歲。根據(jù)FINGO(1995年)臨床分期標準，將宮頸癌進行分期，本研究宮頸癌標本中Ⅰ期26例，Ⅱ期18例，Ⅲ期16例；本研究宮頸糜爛標本中CIN Ⅱ級19例，CIN Ⅲ級16例[9]。標本處理后保存在-70 ℃環(huán)境中備用。

1.2儀器與試劑

1.2.1主要儀器 (1)美國BIO-RAD公司生產(chǎn)的BIO-RAD iCycle實時熒光定量PCR檢測儀;(2)中山柏克電力有限公司生產(chǎn)的UPS不間斷電源;(3)廣州靈潔空氣凈化設備制造有限公司生產(chǎn)的超凈工作臺;(4)湖南湘立科學儀器有限公司生產(chǎn)的CTH1850R臺式高速冷凍離心機;(5)北京時代北利離心機有限公司生產(chǎn)的GT10-1型高速臺式離心機;(6)天津市順諾儀器科技有限公司生產(chǎn)的電熱恒溫水浴箱;(7)德國普蘭德公司生產(chǎn)的八通道可調(diào)移液器;(8)長沙市天天齒科器材有限公司生產(chǎn)的精細組織剪;(9)安徽普若邁德商用電器股份有限公司生產(chǎn)的-130 ℃深低溫冰箱。

1.2.2主要試劑 (1)上海之江生物科技股份有限公司生產(chǎn)的HPV 16、18型核酸測定試劑盒(熒光PCR)；(2)美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)的Agencourt AMPure XP-核酸純化試劑盒；(3)上海紫一試劑廠生產(chǎn)的四甲基乙二胺；(4)國產(chǎn)分析純常規(guī)試劑。

1.3試驗基本要求 為了防止試驗過程中發(fā)生污染，進而防止產(chǎn)生假陽性及假陰性結(jié)果，所有試劑的放置、加入、監(jiān)測等都要在專門試驗區(qū)域；吸頭、試管塞、瓶塞等需要專用并定期嚴格消毒；試管應為一次性使用，且不可混用；每次標本處理完成后均使用次氯酸鈉擦拭臺面，每次操作結(jié)束后均進行無核酸化處理，并進行紫外線消毒[10]。

1.4方法

1.4.1組織標本的采集制作 宮頸癌患者的組織標本來自術(shù)中活檢留取的可疑病變部位和癌旁組織；宮頸糜爛及宮頸組織正常者的組織標本來自于活檢中留取的部分組織。所有標本放置在10%甲醛中固定，迅速送病理科制作HE染色的常規(guī)石蠟切片。

1.4.2HPV DNA的獲取 本研究使用Michael PCR改良法獲取HPV DNA(16、18型)。具體步驟：(1)取約2 g新鮮組織活檢標本，將標本用精細組織剪進行處理后，加入pH8.0的三羥甲基氨基甲烷(Tris)和乙二胺四乙酸(EDTA)配制而成的TE緩沖液[成分為鹽酸(10 mmol/L)-EDTA(0.1 mol/L),0.5%十二烷基硫酸鈉(SDS),20 μg/mL核糖核酸酶]中，并用儀器研磨直到肉眼下看不到塊狀組織為止。(2)將處理后的標本連同100 μL TE緩沖液一起轉(zhuǎn)移到容量為1.5 mL的離心管內(nèi)。(3)在離心管中加入20%SDS直至其濃度為1%為止。將以上組織及溶液充分混合均勻，然后在離心管內(nèi)加入蛋白酶K直至其濃度為100～200 μg/mL為止。以上物質(zhì)充分混合均勻后，放在37 ℃水浴20 h，中間振蕩離心管幾次。(4)以上混合物中加入500 μL的Tris一平衡酚∶氯仿∶異戊醇(混合比為25∶24∶1)，將其混合均勻后離心10 min，取上清液用氯仿∶異戊醇(比例為24∶1)進行抽提，離心10 min,取上清液加入1/10體積3 mol/L乙酸鈉和-20 ℃預冷處理的2倍體積的乙醇，離心5 min后棄上清液，用75%乙醇進行洗滌，自然風干，用50 μL TE進行溶解，作為標本檢測PCR反應模板，置-70 ℃保存待用。

1.4.3PCR擴增 從試劑盒中選取HPV DNA(16、18型)反應液及相關(guān)反應酶，室溫環(huán)境下融化并與獲取的HPV DNA混合物均勻混合，用離心機以2 000 r/min離心10 s。將混合物移入每個PCR反應管內(nèi)，加入2 μL混合物，同時加入宮頸組織正常者混合物上清液、宮頸糜爛者混合物上清液及不同水平的標準物各2 μL，塞緊試管塞。將這些待測反應管轉(zhuǎn)移到監(jiān)測試驗區(qū)，并按順序放置，做好記錄，放在熒光定量PCR檢測儀上進行監(jiān)測(循環(huán))。循環(huán)程序設置為：37 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s。共42個循環(huán)[9]。

1.5統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，采用χ2檢驗和秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1HPV 16、18型DNA在宮頸組織標本檢測情況 60例宮頸癌組織中檢出HPV 16、18型DNA 54例，檢出率為90.00%， DNA模板平均拷貝數(shù)為4.83×105copy/mL，其中HPV 16、18型DNA均檢出者8例，僅檢出HPV 18型DNA陽性者6例，僅檢出HPV 16型者32例。35例宮頸糜爛組織中檢測出5例HPV 16型DNA，檢出率為14.29%，DNA模板平均拷貝數(shù)為5.85×103copy/mL， 未檢出HPV 18型DNA。30例宮頸正常組中HPV 16型DNA及HPV 18型DNA均未檢出，見表1。宮頸癌組、宮頸糜爛組、宮頸正常組HPV DNA平均拷貝數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨著組織病變情況加重，具有明顯相關(guān)性(r=0.88)，見表2。

表1 各類宮頸病變組織HPV 16、18型陽性分布[n(%)]

表2 各類宮頸病變組織HPV 16、18型DNA水平

2.2HPV 16型DNA在標本中的年齡分布情況 HPV 16型DNA在18～40歲標本中共檢出9例，>40～50歲標本中共檢出13例，年齡超過50歲標本中共檢出23例。通過兩兩比較，高危型HPV檢出率在不同年齡組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

目前，隨著宮頸癌發(fā)病率逐漸增加及宮頸癌發(fā)病年齡逐漸減小，其預防和治療越來越重要。早發(fā)現(xiàn)和早預防對于宮頸癌的治療和預后有極為重要的作用。因此，在很多綜合醫(yī)院的婦產(chǎn)科已設立了高危型HPV檢查。有研究表明，對婦女宮頸組織進行HPV DNA檢測，可有效監(jiān)控宮頸癌及癌前病變的發(fā)生和發(fā)展[7]。但是，對于是否將HPV DNA作為宮頸癌篩查的手段，目前學術(shù)界支持和反對意見不一。反對的專家學者認為，全球不同國家地區(qū)的研究表明，細胞學檢查手段可使宮頸癌發(fā)病率和病死率下降很多，因此，僅運用細胞學篩查宮頸癌已足夠，不需要再使用另一種方法；支持的專家學者認為，細胞學檢查雖然可以使宮頸癌的發(fā)病率和病死率下降，但是這種篩查方法成本太高。因為篩查方法的學習需要細胞學的基礎(chǔ)和經(jīng)驗，而這些學習和歷練是一件成本較高、耗時較長的事業(yè)，對于部分國家和地區(qū)，尤其是經(jīng)濟條件較差的地區(qū)，細胞學篩查更加難以普及。而HPV DNA檢測可以采用熒光定量PCR檢測手段進行，成本較低，簡單易學，醫(yī)務人員稍微經(jīng)過學習或培訓就可進行和普及。現(xiàn)在，有不少國家和地區(qū)同意將HPV DNA檢測作為宮頸癌篩查的手段。如法國已將HPV DNA檢測作為篩查宮頸癌的手段，因為HPV DNA采用PCR檢測，其敏感度較細胞學檢查高，原因可能和信號放大作用有關(guān)。

本研究中宮頸癌患者HPV 18型DNA檢出率為23.33%，與文獻[11]報道的廣西壯族自治區(qū)宮頸癌高發(fā)區(qū)人群HPV 18型DNA總檢出率為10.15%差別不大。宮頸癌患者HPV 16、18型DNA的檢出率為90.00%，與文獻[11]報道的流行區(qū)的高危HPV感染率相近。

本研究結(jié)果顯示,在檢出HPV 16、18型DNA的宮頸癌組中，DNA平均拷貝數(shù)為4.83×105copy/mL，與其他組別比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而且HPV DNA的拷貝數(shù)隨病情加重而增加，二者有明顯相關(guān)性(r=0.88)。HPV DNA(16、18型)在宮頸正常組、宮頸糜爛組及宮頸癌組中的檢出率隨宮頸病變嚴重程度而增加，提示HPV感染可能會引起宮頸癌，宮頸癌的重要預防措施之一可能就是預防HPV感染。建議對宮頸糜爛患者行宮頸組織HPV DNA(16、18型)實時熒光定量PCR檢測，從而盡早篩選出宮頸癌發(fā)生的高危人群，并定期隨訪，對于其中發(fā)病者宜及時治療，盡量預防宮頸癌發(fā)生，盡量避免宮頸癌發(fā)展和擴散。

HPV DNA可在宮頸糜爛的治療、篩查及宮頸癌的早期篩查、分型、治療中發(fā)揮重要作用。有研究表明，HPV DNA在宮頸癌的病情預測中有十分重要的參考價值。HPV DNA有多種實驗室檢測手段，常見的為PCR，雖然常規(guī)PCR具有簡單、快捷、敏感度高等優(yōu)點，但是也有無法定量、容易污染而造成假陽性等不足。實時熒光定量PCR技術(shù)解決了常規(guī)PCR的缺點，因此成為近年來的研究熱點。

實時熒光定量PCR檢測技術(shù)實現(xiàn)定量檢測功能的機制是在常規(guī)PCR檢測的基礎(chǔ)上增加了熒光標記探針，在TaqMan酶5′-3′端外切酶的催化下來實現(xiàn)的。是在PCR檢測過程中檢測被檢測物質(zhì)的熒光信號變化，在反應完成后，計算出起始DNA拷貝數(shù)。有研究表明，這項技術(shù)有許多優(yōu)點，不需要在擴增后再進行分析，尤其在進行大范圍檢測時，避免了交叉污染，定量準確[9]。本研究結(jié)果提示，采用實時熒光定量PCR來檢測宮頸組織中HPV 16、18型DNA水平，可以篩查宮頸癌，判斷癌前病變的轉(zhuǎn)歸，觀察治療進展和效果，監(jiān)測病情進展。