葡萄糖磷酸異構酶酶顯色定量測定方法的建立及性能評估*

黃亞麗，趙 珂，魏 芳，馬凱惠，李新華△

(1.山東大學齊魯醫院核醫學科，濟南 250062；2.山東省內分泌與代謝病研究所，濟南 250012；3.山東中醫藥大學附屬醫院普外科，濟南 250000)

類風濕關節炎(RA)是一種病因尚未完全闡明、以侵犯四肢小關節為主的自身免疫性疾病，RA早期即可產生不可逆的骨侵蝕和關節破壞，如果未得到及時治療，RA患者在2～3年的致殘率為60%～70%，因此,RA的早期診斷及規范化治療極為重要[1-2]。近年研究發現，葡萄糖磷酸異構酶(GPI)可作為自身抗原,與自身免疫病尤其是RA密切相關[3]，且與活動期患者的疼痛及腫脹關節數呈正相關[4]。有研究表明，GPI可能通過與抗體復合物激活補體替代途徑，誘發關節炎[5]。本文建立一種定量檢測血清GPI的酶顯色法，并對其進行性能評估，探討此方法是否滿足臨床檢測的需求，為RA 的臨床早期篩查和診斷治療提供技術支撐。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年12月至2016年9月山東大學齊魯醫院風濕科門診和住院患者39例作為RA組，其中男13例，女26例，年齡20～83歲，平均(60±15)歲，所有患者均符合美國風濕病學會聯合歐洲抗風濕病聯盟2009年修訂的RA診斷標準。另選取同期在山東大學齊魯醫院門診就診和住院的患者52例作為非RA組，其中男18例，女34例，年齡19～83歲，平均(54±17)歲，均符合國內或國際相應的診斷標準，其中系統性紅斑狼瘡23例，混合型結締組織病2例，強直性脊柱炎6例，干燥綜合征10例，未分化結締組織病3例,多發性肌炎/皮肌炎5例，脊柱關節病2例，腸病性關節炎1例。選取在山東大學齊魯醫院體檢健康者32例作為健康對照組，其中男10例，女22例，年齡26～81歲，平均(53±16)歲。排除GPI缺乏癥患者，所有受試者均空腹采集靜脈血3 mL，分離血清，-80 ℃冰箱保存備用。所有標本一次凍融后測定。

1.2儀器與試劑 Infinite M200 Pro多功能酶標儀購自瑞士Tecan公司，PHS-3E型pH計購自雷磁公司，Tris購自美國Sigma公司，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)、氯化鉀(KCl)、硫酸鎂(MgCl2)購自西隴化工股份有限公司，D-果糖-6-磷酸二鈉、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、GPI標準品購自瑞士Roche公司，水溶性四氮唑鹽購自南京旋光科技有限公司，檸檬酸、吩嗪硫酸甲酯(PMS)購自阿拉丁公司，乙基苯基聚乙二醇(NP-40)購自安耐吉公司；GPI ELISA試劑盒購自上海北加生化試劑有限公司。

1.3方法

1.3.1原理及操作步驟 (1)原理：根據D-果糖-6-磷酸二鈉在GPI作用下生成葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖-6-磷酸再與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的作用下生成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸與水溶性四氮唑鹽發生顏色反應，在550 nm處有最大吸光度，吸光度值與GPI水平呈正比。(2)操作步驟：試驗前10 min先將R1與R2以1∶1混勻，每孔吸取100 μL，再加10 μL標本37 ℃反應10 min，采用Infinite M200 Pro測定其在550 nm處的吸光度，根據GPI標準品制訂的標準曲線計算出標本中GPI水平。

1.3.2試劑制備 配制稀釋液A ：其中三羥甲基氨基甲烷1 210 mg/L，EDTA-Na2372.24 mg/L，KCl 3 725 mg/L，MgCl21 016.5 mg/L，用1 mmol/L的檸檬酸調節pH至8.05。試劑R1：果糖-6-磷酸1 200 mg/L，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸400 mg/L，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶5 mg/L,用配制稀釋液A來溶解。試劑R2：水溶性四氮唑藍20 mg/L，PMS 2 mg/L，NP-40 1 000 mg/L。試劑制備好均置于2～8 ℃保存備用。

1.3.3性能評價 (1)精密度(CV)與偏倚：抽取2個批次的檢測試劑，分別對水平0.05、0.30、0.60 mg/L的GPI質控品進行測定，每個水平重復20次，計算批內和批間各水平測試結果的CV，并統計各水平測試結果的偏倚情況。(2)干擾試驗：分別檢測標本添加200 mg/L膽紅素、5 g/L血紅蛋白、15 g/L三酰甘油前后的檢測結果，結果相對偏差在±10%以內認為干擾物不影響標本測試。(3)穩定性試驗：試劑置于2～8 ℃保存，14個月(試劑有效期12個月+延長2個月)內每個月分別測試水平為0.05、0.30、0.60 mg/L的GPI質控品，每個水平重復10次，測試結果相對偏差在±20%以內認為試劑穩定性良好。(4)臨床驗證：用本試驗方法檢測123份臨床血清標本，與GPI ELISA試劑盒檢測結果比較，計算兩種方法檢測結果的相關性和偏差。

2 結 果

2.1GPI酶顯色法定量測定的標準曲線 見圖1。分析結果顯示，線性范圍內各水平與測試值呈平滑遞增曲線，標準曲線為Y=0.042 9X+0.108 3，r2=0.992 3。

圖1 GPI酶顯色法測定的標準曲線

2.2GPI酶顯色定量測定方法的精密度與偏倚分析 見表1。采用2批次配液同時測定，每個質控重復測定20次，批內與批間各檢測水平CV<10%，且t檢驗顯示各水平測試結果偏倚可接受(P>0.05)。

表1 兩批試劑精密度與偏倚分析結果比較

2.3各干擾物加入前后測定結果比較 見表2。臨床上對于血清測定的干擾因素主要有脂濁、黃疸和溶血。試驗采用添加干擾物的方式進行，分別在高、中、低值血清中添加不同水平的干擾物質，該試劑在膽紅素水平≤200 mg/L、血紅蛋白水平≤5 g/L、三酰甘油水平≤15 g/L的情況下，各水平范圍的平均偏差均在5%內，根據臨床標準試驗要求偏差應在±10%以內，完全在臨床上使用的可接受范圍內。

2.4穩定性試驗結果比較 見表3。14個月內檢測水平為0.05、0.30、0.60 mg/L的GPI質控品，各水平相對偏差在±20%以內，試劑有效期>12個月。

2.5回收率測定 分析樣品1(GPI水平0.30 mg/L)和樣品2(GPI水平0.60 mg/L)重復測定5次，平均回收水平分別為0.31 mg/L和0.59 mg/L，回收率分別為103.3%和98.3%，平均回收率為100.8%。

表2 各干擾物加入前、后測定結果比較

表3 GPI的酶顯色法定量測定穩定性試驗結果比較

注：0.05、0.30、0.60 mg/L的GPI質控品±20%分別為0.04～0.06、0.24～0.36、0.48～0.72 mg/L

2.6兩種方法檢測3組臨床標本結果比較 見表4。分別采用酶顯色法和ELISA試劑盒檢測123份血清標本，均得到123份有效數據。兩種方法在RA組(n=39)、非RA組(n=52)和健康對照組(n=32)間臨床標本檢測數據比較差異均無統計學意義(Z=-1.38，P>0.05)。

表4 GPI酶顯色法與ELISA試劑盒檢測3組臨床標本GPI結果比較

3 討 論

RA是一種免疫功能紊亂引起的自身免疫性疾病，患者體內存在多種自身抗原和自身抗體，其具體病因和發病機制目前尚不完全明確，探討其發病機制對于RA的診治和預防至關重要。GPI是一種廣泛表達并且具有多種功能的蛋白質，它是能量循環和糖分解過程中必不可少的胞漿酶，同時它又是細胞外信號的傳導分子[6]。GPI分泌運動因子和神經細胞因子，可能在腫瘤和自身免疫方面起一定作用[7-8]。GPI可誘導C57BL/10小鼠產生關節炎，疾病的發生與Ⅱ型主要組織相容性復合體相關[9]。GPI水平在RA活動組和非活動組差異有統計學意義(P<0.05)，與RA患者的關節腫脹、疼痛呈正相關。GPI對于RA疾病的早期診斷，了解病情的發生和發展、治療及判斷預后均有重要價值[8]。關于GPI及其抗體在RA中的診斷價值，大多數研究結果表明,GPI抗原診斷RA的敏感度>65%，特異度≥90%，有較高的診斷價值[9-10];而抗GPI抗體在RA診斷中的研究結果差異較大，特異度為64.3%～95.9%[11-12]。因此，臨床實驗室可選擇合適的標志物聯合檢測來提高特異度和敏感度，更好地對RA 進行診斷及療效觀察。所以迫切需要一種能快速準確且敏感度和精密度高的檢測GPI的方法來滿足RA的臨床診斷。

本研究建立了一種新的快速檢測血清GPI的方法，檢測線性范圍為0.000 82～2.500 00 mg/L，在線性范圍內有較好的精密度和準確度。穩定性試驗結果顯示，12個月內檢測水平為0.05、0.30、0.60 mg/L的GPI質控品，各水平相對偏差可控制在允許范圍內，認為試劑有效期>12個月。干擾物膽紅素(200 mg/L)、血紅蛋白(5 g/L)、三酰甘油(15 g/L)不影響試劑檢測。GPI酶顯色法檢測結果與ELISA試劑盒的測定結果有良好的相關性，且兩種方法測定結果差異無統計學意義(P>0.05)。

隨著GPI檢測項目在臨床應用的快速開展，對于檢測技術的快速準確和高效提出了新的要求。本研究建立的GPI酶顯色法定量檢測試劑敏感度、精密度和特異度較高，可重復性和穩定性較好，與GPI ELISA試劑盒的測定結果比較有較好的一致性。與現有同類產品相比，本研究的創新點在于：(1)可采用酶顯色法對GPI進行定量檢測；(2)操作簡單快速，相比現有定量檢測產品檢測時間短；(3)無需配備大型儀器設備，使用成本相對低廉，適合于地方基層醫院應用。本研究不足之處是標本量較少，仍需要收集更多的病例來驗證該試驗結果，還應同時開展深入大量的臨床研究來確定不同地區、不同人種、不同實驗室建立相應的診斷標準。