術前中性粒細胞與淋巴細胞比值對乳腺腫瘤的預測價值及其與Beclin1的關系*

宦 宇,蔡徐山△,焦家軍,張春利

(上海市嘉定區婦幼保健院:1.檢驗科;2.乳腺科 201821)

炎性反應與多種腫瘤相關，腫瘤的微環境在腫瘤進展中起重要作用，可促進腫瘤細胞增殖與轉移。中性粒細胞與淋巴細胞計數比值(NLR)已成為全身炎性反應簡單且有效的指標。有研究證明，NLR 增高在乳腺癌中可作為預后不良的獨立危險因素[1]，且對乳腺癌復發和轉移有預測價值[2]。Beclin1是形成自噬體的必須分子，可介導自噬相關蛋白定位于吞噬泡，并與多種蛋白反應調控自噬體形成與成熟。而自噬功能缺乏可刺激炎癥小體形成,適度自噬可抑制炎性反應[3]。本研究探討外周血NLR 與乳腺癌臨床病理特征之間、自噬相關基因在乳腺癌中的表達情況，以及二者之間的關系。從而評估NLR對乳腺腫瘤的預測價值，同時試圖對炎性反應、自噬、腫瘤三者之間的關系做簡單解釋。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2017年8月在本院接受手術治療，且經病理科證實為原發性浸潤性乳腺癌的患者共126例作為乳腺癌組，均為女性，年齡33～69歲，中位年齡56歲，所有病例手術前均未做過任何化療、放療及生物治療。另選取同期病理檢查均為纖維腺瘤的良性乳腺腫瘤患者102例作為乳腺良性腫瘤組，乳腺良性腫瘤組病例也均為女性，年齡31～67 歲，中位年齡52歲。乳腺癌腫瘤組織為術中取得，同時選取距離病灶位置至少3 cm處的癌旁組織進行比較，所有組織標本均置于RNALater保存液中-80 ℃冰箱保存。所有患者的臨床資料，如腫瘤塊大小、腫瘤級別、淋巴結入侵情況、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長因子受體2(HER2)的表達等均來自本院病理科。排除標準：70歲以上患者;術前感冒或其他可影響血常規計數結果的疾病患者。

1.2儀器與試劑 全自動血細胞分析儀MEK-8222k極其配套試劑(日本光電公司)，熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀(ABI 7300)，反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒(TAKARA公司)，RNAlater(QIAGEN公司 )，Tizol試劑。

1.3方法

1.3.1血標本采集與處理 患者于術前2 d內采集晨起空腹外周靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝。采血當天無發熱等臨床感染征象。檢測白細胞、中性粒細胞及淋巴細胞計數，外周血NLR 由中性粒細胞計數/淋巴細胞計數獲得，檢測在2 h內完成。

1.3.2RT-PCR分析 按Tizol試劑說明書步驟提取組織總RNA。Beclin1、GAPDH引物均由上海英淮捷基公司合成。Beclin1上游引物序列為5′-GGC TGA GAG ACT GGA TCA GG-3′，下游引物序列為5′-CTG CGT CTG GGC ATA ACG-3′,產物長度為364 bp。GAPDH上游引物序列為5′-ACT TTG GTA TCG TGG AAG GAC TCA T-3′,下游引物序列為5′-GTT TTT CTA GAC GGC AGG TCA GG-3′,產物長度為255 bp。反轉錄擴增條件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；4 ℃ 1 min。PCR擴增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，70 ℃ 50 s，循環40次；70 ℃ 5 min。

2 結 果

2.1外周血NLR與乳腺良、惡性腫瘤的關系 乳腺良性腫瘤組NLR為1.22±0.29，乳腺癌組為2.10±0.78，兩組差異有統計學意義(t=11.72，P<0.05)。

2.2乳腺癌組術前外周血NLR與臨床病理特征的關系 見表1。不同年齡分組中NLR差異有統計學意義(P<0.05)；無淋巴結轉移患者NLR明顯低于有淋巴結轉移患者，差異有統計學意義(P<0.05)；Ki67表達率大于或等于20%的患者NLR明顯高于表達率低于20%的患者，差異有統計學意義(P<0.05)；而腫瘤直徑、病理分級、ER、PR、HER-2等臨床病理特征分組中NLR差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 乳腺癌組術前外周血NLR與臨床病理特征的關系

2.3乳腺癌組織和癌旁組織中Beclin1 mRNA的表達 隨機挑選20例乳腺癌組織和與其對應的癌旁組織，采用RT-PCR檢測組織中Beclin1 mRNA表達水平。圖1所示，乳腺癌組織中Beclin1 mRNA表達水平平均為1.35±0.96，而癌旁組織平均為 3.17±1.59,兩組差異有統計學意義(P<0.05)。在80%(16/20)的標本中發現，Beclin1在乳腺癌組織標本中表達下調，另有20%(4/20)的標本中未發現Beclin1在乳腺癌組織中表達下調。

圖1 乳腺癌和癌旁組織標本中Beclin1mRNA表達水平

2.4Beclin1 mRNA的表達和外周血NLR的關系 根據腫瘤組織和癌旁組織Beclin1 mRNA表達水平差異情況,將上述20例患者標本分為Beclin1 mRNA表達下調組和未下調組，結果顯示，Beclin1 mRNA下調組外周血NLR為3.15±1.54,未下調組為1.07±0.19,兩組差異有統計學意義(t=-3.714,P<0.05)。

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年其發病率已位居我國女性惡性腫瘤的首位，且逐年遞增[4-6]。近年研究發現，NLR與多種實體腫瘤的預后相關，可能原因是升高的NLR與炎性反應相關[7-10]。NLR 在臨床中有獲取簡便，不額外增加檢測費用，臨床可操作性強等優點。細胞自噬是不同于凋亡且不依賴于caspase的一種程序性細胞死亡，它作為程序性細胞死亡的另一種形式，近年來受到廣泛關注。第一個哺乳動物自噬基因是Beclin1，它是哺乳動物參與自噬的特異性基因，廣泛存在于人類正常組織中。

本研究發現,術前外周血乳腺癌組較乳腺良性腫瘤組NLR明顯升高，提示NLR有助于判斷乳腺良、惡性病變。NLR所受干擾因素較多，如感冒、高血壓、腎臟疾病、糖尿病、高膽固醇等，甚至吸煙、飲食、飲酒等生活習慣也會干擾其檢測結果，所以目前NLR用于乳腺腫瘤良、惡性判斷的臨界值尚很難確定，臨床工作中仍然最終需要病理活檢作為診斷的金標準。但本研究結果提示,NLR可作為判斷乳腺腫瘤良、惡性病變的一項參考指標。

詹妍等[1]研究發現,NLR與淋巴結轉移數目、TNM分期及ER、PR、HER2相關,與年齡等因素無關；胡赟宏等[2]研究發現,NLR僅與淋巴結轉移數目相關，與其他臨床病理因素均無關。本研究結果顯示,NLR在年齡大小、有無淋巴結轉移、Ki67表達率高低患者間有明顯差異。但未發現與其他乳腺癌相關臨床特征相關，這可能是因為NLR受病理生理因素影響較大，不同的研究者統計分析結果存在差異，所以還需更大標本量的研究予以證實。另有研究發現，NLR可能與乳腺癌不同的分子分型相關[11]，這一結果為進一步研究提供了思路和方向。

有學者采用免疫組織化學法分析乳腺癌細胞系和乳腺癌及其與之對應的正常乳腺組織。Beclin1免疫活性在正常乳腺上皮細胞中強烈表達,而乳腺癌組織中的表達水平卻明顯下降。本研究采用RT-PCR檢測Beclin1 mRNA的表達水平，結果顯示，Beclin1 mRNA在乳腺癌組織的表達低于癌旁組織，與文獻[12-13]報道一致。

有研究發現,炎性反應介質中的活性氧細胞因子及炎性反應相關轉錄因子可調控自噬反應，而自噬反應又可通過TLR、NLR 等信號通路來調節炎性反應，并且自噬反應是誘發炎性反應性疾病的重要因素[14]。對于信號、轉導通路及調節自噬體形成和成熟過程的相關信號通路的分子機制和功能研究表明,Ⅰ型磷酸肌醇3-激酶-蛋白激酶B信號轉導通路和腺苷酸活化蛋白激酶信號通路都可調節自噬反應的過程，換句話說自噬反應與癌癥的發生和發展有關[15]。本研究為了初步探討炎性反應、自噬、腫瘤三者之間的關系，根據Beclin1 mRNA的表達下調情況將腫瘤患者進行分組分析發現，Beclin1 mRNA表達下調組外周血NLR與未下調組差異有統計學意義(P<0.05)。但由于本研究標本量有限，且缺少相關機制研究，炎性反應、自噬反應、腫瘤三者之間的關系是否確實如本研究結果所示，還有待進一步驗證。