一起多血清型副溶血性弧菌聚集性腹瀉事件的病原分析*

施怡茹，陳洪友，盧曉蕓，趙錦江，高紅梅，馬 英，徐秋芳△

(1.上海市青浦區疾病預防控制中心 201700；2.上海市疾病預防控制中心 200336)

副溶血性弧菌(Vp)主要分布于近海海水、海河交界處、海產品和腌制產品中，是夏、秋季沿海地區引起腹瀉性疾病的主要食源性病原菌，其主要致病因子為耐熱直接溶血素(TDH)和耐熱直接溶血素相關溶血素(TRH)，攜帶有TDH或(和)TRH的菌株被稱為產毒株[1-3]。2016年8月上海市某區發生一起聚集性腹瀉事件,在某賓館就餐的人員中，陸續有29人出現惡心、腹痛和腹瀉等不適癥狀，均前往醫院就診并采取肛拭樣品。經流行病學調查，該29例患者均在27日于該賓館就餐，膳食由賓館食堂燒制，發病前5 d內均無其他集體性聚餐活動。28日03:00出現首發病例，最后1例出現于29日04:00。患者主要癥狀為不同程度的惡心、嘔吐、水樣便腹瀉、上腹或臍周痛(絞痛或陣發痛)，個別病例伴有頭暈、頭痛。相關工作人員現場采集可疑樣品，送往實驗室進行分離檢測和溯源分析。

1 資料與方法

1.1一般資料 29例患者肛拭樣品、6份留存食品樣品、6份餐具樣品和5份餐廳從業人員肛拭樣品，均嚴格無菌采樣，并于2 h內送檢。

1.2主要儀器 德國艾本德Reaiper4(Eppendorf)聚合酶鏈反應(PCR)儀；美國Bio-Rad CHEF Mapper脈沖場凝膠電泳儀；美國Applied Maths公司BioNumerics7.1分析軟件；美國伯樂Bio-Rad GEL DocTMXR凝膠成像儀；法國生物梅里埃公司(BIOMERIEUX)VITEK_2_Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統。

1.3主要試劑 Vitek 2 GN生化鑒定板條[法國生物梅里埃公司(BIOMERIEUX)]；Proteinase K、XbaⅠ、NotⅠ限制性內切酶(Takara生物工程有限公司)；SeaKem Gold Agarose(美國Cambraex Bio Rockland公司)；Gelred染色液(美國BIOTIUM公司)；副溶血性弧菌血清(Denka Seiken，日本)；革蘭陰性需氧菌藥敏試驗檢測板(上海星佰生物技術有限公司)；Premix ExTaq Version20、DL2000TM DNA Maeker(Takara生物工程有限公司)。所有增菌液和培養基均由上海華康科技公司和上海科馬嘉科技公司提供。所有試劑均在有效期內使用。

1.4方法

1.4.1菌株分離及鑒定 肛拭樣品按照《感染性腹瀉的診斷標準》WS271-2007進行分離檢測，食品樣品按照GB 4789.7-2013、GB 4789.10-2010、GB 4789.4-2010、GB 4789.5-2013、GB/T4789.6-2003等標準要求進行檢測，經全自動微生物生化鑒定確證。

1.4.2菌株血清分型 用Vp 11種O抗原(O1～O11)及65種K抗原(K1、K3～K13、K15、K17～K26、K28～K34、K36～K61、K63～K71)進行血清分型[4]。

1.4.3PCR檢測TRH、TDH、toxRS-new、toxRS-old和orf8-up基因 熱裂解法提取VpDNA，PCR檢測目的基因，引物序列參考文獻[2,5]，見表1。各引物分別進行PCR，反應體系為：PREmix TaqTM(TaKaRa Code：RR901A)為12.5 μL，DNA模板為1.5 μL，按表1所示的引物終濃度加入相應體積的各種引物，加無菌蒸餾水補足總體積為25.0 μL；PCR循環反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 60 s，52 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，循環25次，各PCR反應體系的退火溫度見表1[4]。最后取5.0 μL產物置于1%瓊脂糖凝膠電泳中電泳30 min。

表1 引物名稱、序列及預期產物大小

1.4.4藥敏試驗 選取氨芐西林、慶大霉素、四環素、阿奇霉素、氯霉素、復方磺胺甲噁唑、環丙沙星、萘啶酸、頭孢唑啉、阿莫西林/克拉維酸、頭孢西丁、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、亞胺培南、氨芐西林/舒巴坦、頭孢呋辛等17種抗生素，選用肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度，按照藥敏試驗檢測板試劑盒說明書進行具體操作和結果判斷。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，由上海市疾病預防控制中心提供。

1.4.5PFGE分子分型 參考美國疾病預防控制中心PulseNet USA的方法。作為相對分子質量標準的參考菌株為H9812，由上海市疾病預防控制中心提供，用XbaⅠ酶切；Vp用NotⅠ酶切；圖譜用BioNumerics7.1軟件分析。

2 結 果

2.1病原學檢測結果

2.1.1分離培養結果 從20例患者肛拭樣品和1例餐廳從業人員肛拭樣品中分離出疑似Vp，其在弧菌顯色平板上為圓形、扁平、濕潤、不透明、紫色的大菌落。未檢出其他致病菌(金黃色葡萄球菌、沙門菌、志賀菌、致瀉性大腸桿菌)。

2.1.2菌體形態與生化結果 經革蘭染色鏡檢，該21株可疑菌均為革蘭陰性無芽孢桿菌，在3%氯化鈉三糖鐵斜面上均為斜面紅色、底層黃色、不產氣、硫化氫陰性。經Vitek 2 GN生化鑒定板條確證，該21株可疑菌均為Vp，生化結果見表2。

2.2血清分型結果 該21株Vp可分為4種血清型別，分別為O3:K6型15株，占71.43%，O4:K8型4株，占19.05%，另有2株K抗原不可分型的菌株，即O3:KUT和O4:KUT 各1株，KUT為O和(或)K不可分型者，見表3。

2.3tdh、trh、toxRS-new、toxRS-old、orf8-up基因檢測 結果顯示，所有菌株均不含毒力基因trh；僅1株血清型O3:KUT的菌株tdh基因為陰性，其余菌株tdh基因均為陽性，攜帶率為95.24%。血清型O3:K6菌株均為toxRS-new、orf8-up陽性，toxRS-old陰性；其余血清型別的菌株該3種基因攜帶情況與O3:K6相反，見表3。

表2 21株疑似菌株生化鑒定結果

注：+為陽性，-為陰性

表3 毒力基因、血清分型結果

續表3 毒力基因、血清分型結果

注：+為陽性，-為陰性

2.4藥敏試驗結果 見表4。21株Vp藥敏試驗結果基本一致，氨芐西林和頭孢唑啉耐藥率為100.00%，復方磺胺甲噁唑耐藥率為95.24%，萘啶酸耐藥率為19.05%，頭孢西丁耐藥率為9.52%，四環素耐藥率為4.76%，其余11種抗生素敏感率均為100.00%。

表4 21株Vp藥敏試驗結果[n(%)]

2.5PFGE分型結果 21株Vp的PFGE圖譜采用Bio Numerics7.1軟件進行聚類分析，以Dice系數計算相似度，UPGMA法建樹，差異<4的菌株可歸為同一聚類。分析結果顯示，基因組DNA片段得到較好的分離。按照100%相似度可分為7種帶型，不同血清型別的菌株互為不同的帶型，且同源性較低，見圖1。血清型O3:K6有3種帶型：VP16001、VP16002、VP16003，其之間的同源性分別為96.30%和81.70%，其中VP16003為主要優勢型別，有9株，占42.86%，VP16001次之，有4株，占19.05%；血清型為O4:K8有兩種帶型：VP16004和VP16005，其之間的同源性為90.0%；相同血清型的不同PFGE帶型之間條帶差異均<4。

圖1 Vp PFGE聚類分析圖

3 討 論

Vp主要引起人體以發熱、嘔吐、腹瀉等癥狀為主的急性腸胃炎，其引發的食源性發病案例分布世界各地[6-7]。全國突發公共衛生事件的網絡數據顯示，在總體食物中毒原因中，Vp位居第2[4]；在上海地區導致食源性疾病的發病率為76.5人次/10萬[8-9]。

本次聚集性腹瀉事件分離得到21株Vp，從患者肛拭樣品中檢出的20株Vp均攜帶tdh基因，不攜帶trh基因，分離自餐廳從業人員的1株Vp不含毒力基因tdh和trh，即為不產毒株，不具備傳染、侵襲他人的毒力。

MATSUMOTO等[10]利用toxRS基因序列建立了toxRS-new用于檢測O3:K6，以區分大流行菌株與非流行菌株。toxRS-new陽性菌株可判為大流行菌株，具有致病性強、tdh陽性、trh陰性等特點，其中超過96%的菌株攜帶f237噬菌體的orf8片段[11]。O3:K6是上海地區腹瀉人源性Vp的優勢血清型[1]。O3:K6也是環太平洋地區、歐洲地區大流行菌株的優勢血清型[4-5]。此次聚集性腹瀉事件Vp的優勢血清型別為O3:K6，與上海地區一致；毒力基因攜帶情況符合大流行菌株特點；其余3種血清型別(O4:K8、O3:KUT、O4:KUT)是O3:K6關系相近的血清型變種[5]。

根據學者提出的有關菌株同源性的判斷標準及同源性≥85%的菌株可被認為是來源同一克隆株的理論，該起事件檢出的21株Vp中，相同血清型的不同PFGE帶型之間存在1～3個條帶差異，具有高度同源性，為同一聚類，可能來自同一污染源。

藥敏試驗結果顯示，21株Vp的抗生素耐藥情況基本一致，與文獻[12-13]報道基本一致，對氨芐西林和頭孢唑啉的耐藥率最高，達100.00%，對頭孢他啶、四環素、阿莫西林/克拉維酸等均敏感。近年來，濫用抗生素及細菌之間耐藥基因傳遞等原因使細菌耐藥情況愈發嚴重，進而受到廣大醫務人員的重視[13-14]。因此，需密切關注Vp的耐藥情況及變化，以期有效指導臨床合理使用抗生素。

綜上所述，此次聚集性腹瀉事件是由O3:K6和O4:K8兩種血清型為主的5種不同克隆株Vp混合感染引起的。而分離自餐廳從業人員的菌株為非產毒株，與分離自患者的Vp，可視為無相關性。因此，引起此次事件的病原菌來源尚未確定，不排除由于此次送檢的可疑樣品不全，未采集到致病菌污染樣品。建議相關部門在處理此類事件時，應擴大可疑食物或相關環節樣品的采樣范圍。此次事件可懷疑為該賓館食堂用具被多種血清型Vp污染，或是食品在烹煮過程中存在尚未熟透的現象，或是食堂廚房存在用具生熟未嚴格分開、食品儲存保管不當等，均是造成Vp迅速繁殖、多重污染并引起聚集性腹瀉事件的可能原因。