轉化生長因子-β1對腫瘤血管形成的影響*

馬 銳，萬巧鳳，于 佳

(寧夏醫科大學基礎醫學院，銀川 750004)

正常機體在生理狀態下血管新生是暫時的，并且機體嚴密監視、控制這一過程。但在病理條件下，血管內皮細胞促進血管生長的能力將使增生組織或細胞異常增殖。同時，血管形成受多種信號調控，這些信號能夠調控血管生成的狀態，包括基因突變、免疫細胞在局部浸潤、代謝應激(如缺氧、酸中毒、堿中毒、低血糖)、增殖壓力改變等。轉化生長因子-β(TGF-β)有許多生物學作用，如參與胚胎發育、調節細胞的生長、增殖和分化，甚至誘導程序性死亡；另外，TGF-β還參與細胞外基質形成、抑制細胞因子產生，促進黏附分子表達，進而抑制免疫應答，修復受損組織等。TGF-β家族中研究最多的是TGF-β1，它是一種多功能生長因子，分布于多種組織細胞內，激活其下游的胞內信號蛋白，介導TGF-β1的信號傳遞，進而發揮重要生物學效應。有研究顯示，在成纖維促血管生成中，TGF-β1信號通路可以誘導成纖維細胞表型發生改變，促進肌動蛋白α(α-SMA)和血管內皮生長因子(VEGF)A表達,使成纖維細胞形成小管樣結構[1]。有研究表明，TGF-β基因敲除的小鼠表現有血管發育缺陷，致胚胎死亡[2]。目前TGF-β對血管內皮細胞的作用及轉導通路研究還比較少，GATA6能夠與TGF-β基因的啟動子結合，參與調控血管內皮細胞功能。而GATA6分子在血管內皮細胞內廣泛表達，維持血管內皮細胞的生存和調節周圍血管[3]，這些理論知識為利用TGF-β1刺激大鼠內皮細胞提供了有利條件。

1 材料與方法

1.1材料 SD健康雄性大鼠，6～8周，體質量160～200 g，購于寧夏醫科大學實驗動物中心。人乳腺癌細胞株MDA-MB-231(上海美軒生物科技有限公司)，TGF-β1(Invitrogen公司)，Matrigel膠(BD公司)，ECM培養基(Invitrogen公司)，全自動數碼凝膠成像分析儀(Bio-Rad公司)，超凈工作臺(蘇州蘇潔醫療)，CO2恒溫培養箱(博科公司)，生物安全柜(Thermo公司)，普通倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠主動脈環形成試驗 SD大鼠戊巴比妥鈉腹腔麻醉后打開腹腔，迅速分離出大鼠的胸主動脈，若有出血，用紗布拭去，保持視野清晰(過程中注意無菌操作)；Matrigel膠提前從-20 ℃移至4 ℃冰箱過夜，將Matrigel膠加入48孔板中，并在37 ℃培養箱中放置30 min，使其凝固。小心將大鼠的胸主動脈結締組織和脂肪剔除掉，注意不能剪破血管；放入盛有100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的冰磷酸鹽緩沖液(PBS)中，再將動脈剪成小段，每段長度1～2 mm；用PBS清洗主動脈環，取出37 ℃培養箱中的48孔板，將動脈環小心接種到48孔板的Matrigel膠上；再將液態Matrigel膠覆蓋于環上，形成夾心狀；37 ℃培養箱中放置30 min，使其凝固；凝固后，在每孔Matrigel膠上層給予3.125、6.250、12.500 ng/mL TGF-β1(ECM培養基配制)的MDA-MB-231細胞培養基上清液，比較各種TGF-β1水平對大鼠主動脈環形成的影響。同一水平設3個復孔置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，每兩天換1次，每日拍照。

1.2.2新生血管分支長度比較 倒置顯微鏡觀察大鼠主動脈形成的血管分支，對不同組別進行測量并統計。

2 結 果

2.1大鼠主動脈環血管形成試驗 見圖1。

注：A為3.125 ng/mL TGF-β1組；B為6.250 ng/mL TGF-β1組；C為12.500 ng/mL TGF-β1組

圖1各種TGF-β1水平對大鼠主動脈環形成的影響(×120)

2.2不同水平TGF-β1刺激試驗大鼠新生血管分支長度比較 誘導48 h后，3.125、6.250、12.500 ng/mL TGF-β1刺激試驗大鼠主動脈環外周血管分支長度分別為(0.600±0.041)、(0.900±0.309)、(1.200±0.238)mm，差異有統計學意義(P<0.05)。表明MDA-MB-231人類乳腺癌細胞經TGF-β1誘導后，血管分支長度增加。

3 討 論

目前，乳腺癌仍是導致女性死亡的重要疾病,雖然現代診斷和治療技術不斷提高，乳腺腫瘤患者病死率逐年下降，但其病死率仍高達35%。因此，篩選出具有早期診斷價值的靶標分子，對于改善預后意義重大。TGF-β1及其下游信號通路研究目前已成為腫瘤研究的熱點[3-4]。作為DPC4基因的傳遞蛋白，TGF-β1已被證明DPC4突變或缺失與多種腫瘤相關。在腫瘤細胞分泌的眾多因子中，何種因子介導內皮細胞從原有血管出芽形成新的腫瘤血管，并發揮的關鍵作用還不十分清楚。血管生成后，血管大量增殖，形成類似毛細血管網的細胞環狀結構，這是腫瘤新血管生長的重要步驟。

目前已有許多藥物針對血管生成靶向性方向治療乳腺腫瘤，如索拉非尼[5]。在健康人體內，血管生成是被嚴格控制的，但在腫瘤組織中，血管生成迅速，一方面供給腫瘤組織營養，另一方面實現腫瘤細胞遠端轉移。因此，如何行之有效地切斷腫瘤組織血管生成途徑，已被研究人員公認為是治療腫瘤的有效途徑。尤其是某些促血管生成因子，可以在原有管腔內大量釋放，這些因子似“誘餌”激活血管內皮細胞表面的相應受體，如VEGF-VEGFR結合、活化內皮細胞、釋放水解酶及蛋白酶，發揮纖維溶解作用，溶解血管基底膜[6-7]。探明以上機制，對于腫瘤細胞如何最終形成管腔，以致成熟血管形成，具有重大現實意義。

本研究旨在研究TGF-β1對于乳腺腫瘤細胞血管生成的影響；為腫瘤細胞侵襲、遠端轉移等提供理論佐證，進而對TGF-β1及其受體、信號通路研究提供了前期基礎[8-9]。在前期多次預試驗的基礎上，本研究分離出大鼠胸主動脈，并制作體外主動脈環試驗模型，借助Matrigel膠模擬的細胞內基質環境，進行血管形成試驗觀察。48 h后經倒置顯微鏡比較發現，人類乳腺癌細胞MDA-MB-231經TGF-β1誘導后，血管出芽數量、密度增加，而且血管分支長度也增長。TGF-β1使MDA-MB-231人類乳腺癌細胞遷移和血管生成的能力增強，在后續研究中，作者將對其調控的分子機制進行進一步探究。