艾滋病合并結核病患者結核分枝桿菌耐藥基因突變特征分析*

謝 祺，張 米，雷素云，高 麗，張桂仙，楊海花，董興齊

(云南省傳染病專科醫院檢驗科，昆明 650301)

全球人類免疫缺陷病毒合并結核分枝桿菌(HIV/MTB)感染的病例逐年增多，每年增幅近10%[1]。2016年全世界1 040萬新發結核病患者中估計有103萬(9.9%)為HIV感染者，其中死于HIV相關結核病的人數達37.4萬。在HIV感染者中結核病控制面臨的最大問題是無法準確、快速地診斷出結核病患者[2]。故HIV/MTB感染給艾滋病及結核病的預防和治療帶來了巨大的挑戰，也成為全球極其緊迫的公共衛生問題。耐多藥結核病發現和治療危機仍然嚴重，2016年共新發1 040萬結核病，其中新發耐多藥結核病病例估計有49萬，其中只有近13萬登記接受診療；2013年，全球耐多藥結核病治療成功率為52%[2]。此外，HIV/MTB感染者的診治有其特殊性，涉及抗結核和抗-HIV治療2個方面，藥物不良反應、服藥依從性、藥物間相互作用均會影響治療效果，HIV感染者結核病的治療成功率也相對較低[3]。MTB耐藥性監測對HIV/MTB感染者極為重要。利福平(RFP)和異煙肼(INH)是結核病治療中最重要的兩種一線藥物，結核病患者如果對這兩種藥物產生耐藥將給治療帶來極大的困難。了解RFP及INH耐藥株相關耐藥基因突變特征，對揭示MTB耐藥機制，實現對耐藥MTB的快速檢測有重要意義。本研究采用基因芯片技術對云南省208例HIV/MTB感染者標本進行MTB耐RFP基因RNA聚合酶β亞單位編碼基因(rpoB)，耐INH基因過氧化氫酶-過氧化物酶編碼基因(katG)、烯酰基還原酶編碼基因(inhA)的常見突變位點檢測，以了解云南省HIV/MTB感染者MTB耐RFP基因rpoB、耐INH基因katG、inhA突變頻率和突變特征，以期闡明云南省HIV/MTB感染者MTB對RFP和INH的耐藥機制及分子基礎，為HIV/MTB感染者MTB耐藥的快速診斷和篩選提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012年9月至2017年12月本院感染科收治的HIV/MTB感染者208例，其中男144例，女64例，年齡17～83歲，平均(39.9±12.7)歲。所有患者HIV感染的診斷均符合原國家衛生部2008年頒布的《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標準》，所有患者標本抗酸染色或分枝桿菌培養陽性且經基因芯片技術菌種鑒定證實為MTB。208例標本中痰液152例，膿液20例，灌洗液15例，胸腔積液13例，腹水4例，糞便4例。

1.2儀器與試劑 采用北京博奧生物有限公司生產的MTB耐藥基因芯片檢測試劑及LuxScan10K-B微陣列芯片掃描儀等配套儀器進行檢測。

1.3方法 MTB耐藥基因檢測包括兩種一線藥物(RFP及INH)的3種耐藥相關基因(rpoB、katG及inhA)啟動子的野生型及不同變異型。對于RFP耐藥相關基因rpoB檢測6個位點，包括531位TCG→TTG、531位TCG→TGG、526位CAC→GAC、526位CAC→TAC、526位CAC→CTC、526位CAC→CGC、511位CTG→CCG、513位CAA→CCA、513位CAA→AAA、516位GAC→GTC、516位GAC→TAC、516位GAC→GGC、533位CTG→CCG等13種突變型；對于INH耐藥相關基因katG及inhA基因啟動子各檢測1個位點，分別為katG基因315位AGC→ACC和AGC→AAC 2個突變型，inhA基因啟動子15位C→T突變型。檢測探針和對照探針各重復5個點，每行1～5和6～10分別為同一探針，RFP相關rpoB基因的探針排列示意見表1，INH相關katG基因和inhA基因的探針排列示意見表2。

表1 RFP相關rpoB基因的探針排列

注：QC為表面化學質控探針；EC為雜交陽性外對照探針；BC為空白對照；NC為陰性對照探針；IC為內對照探針；WT為野生型

表2 INH相關katG基因和inhA基因的探針排列

注：QC為表面化學質控探針；EC為雜交陽性外對照探針；BC為空白對照；NC為陰性對照探針；IC為內對照探針；WT為野生型

1.3.1標本制備 取患者標本加入離心管中，95 ℃水浴30 min滅活處理后加等體積N-乙酰-L半胱氨酸-氫氧化鈉對標本進行液化處理，取1 mL液化標本加入離心管高速離心后去上清液備用。將處理好的標本放入晶芯ExtractorTM 36核酸快速提取儀中提取核酸，再將提取到的核酸加入到基因擴增儀中進行擴增，并將得到的核酸置于-20 ℃保存。

1.3.2芯片雜交 取雜交緩沖液9 μL、聚合酶鏈反應(PCR)產物6 μL，混勻，95 ℃熱浴5 min，變性，在冰水混合物中驟冷3 min。取13.5 μL雜交溶液加入芯片，置雜交儀，50 ℃雜交2 h后置洗干儀內洗滌甩干。

1.3.3掃描判讀 將芯片插入芯片掃描儀內，運行芯片掃描和結果判讀。

2 結 果

2.1RFP和INH總體耐藥情況 208例標本中共發現34例(16.3%)耐藥，其中單耐RFP 6例(2.9%)，單耐INH 10例(4.8%)，二者同時耐藥18例(8.7%)。

2.224例MTB對RFP耐藥相關基因rpoB的突變特征 見表3。208例標本中共發現24例RFP耐藥基因rpoB發生突變，總突變率為11.5%，其中單位點突變23例(95.8%)，突變形式主要為rpoB531TCG→TTG；雙位點突變1例(4.2%)，突變形式為rpoB511CTG→CCG加rpoB516GAC→TAC。

表3 24例MTB對RFP耐藥相關基因rpoB的突變特征

2.328例MTB對INH耐藥相關基因katG和inhA的突變特征 見表4。在208例標本中共發現28例INH耐藥基因katG和inhA發生突變，總突變率為13.5%，其中katG突變及缺失26例，突變形式主要為katG315 AGC→ACC；inhA突變2例，突變形式為inhA-15C→T。

表4 28例MTB對INH耐藥相關基因katG和inhA的突變特征

3 討 論

RFP與INH是應用最廣泛的一線抗結核藥物，二者組合能取得較好的療效，但由于長期治療不當，包括治療方案不當、劑量不足、患者依從性差等原因，RFP與INH耐藥率呈上升趨勢，這也是TB在全球再次暴發難以控制的主要原因之一。MTB的耐藥性是相關基因突變引起的，故對RFP和INH的耐藥性進行檢測對臨床治療結核有積極意義[4]。

傳統的MTB藥敏試驗陽性率低、培養周期長，給臨床上HIV/MTB感染者的診斷和治療帶來了極大的困難。基因芯片是近幾年在醫療領域最具影響力的分子生物學檢測技術，可通過檢測耐藥突變基因的存在與否協助判斷MTB的耐藥情況。國內多中心驗證結果表明，基因芯片技術檢測RFP、INH耐藥性，其敏感度分別為87.56%、80.34%，特異度分別為97.95%、95.82%[5]。基因芯片技術適宜多種類型標本的檢測，檢測時間較傳統方法明顯快速，從而做到及早診斷、及時選擇敏感藥物，及時控制結核病疫情。

多項研究結果表明，HIV/MTB感染者對抗結核藥物的耐藥性以耐RFP和INH最為突出。王印等[6]報道，成都地區196例HIV合并MTB雙重感染者MTB總耐藥率為26.02%，其中INH和RFP在4種一線抗結核藥中耐藥率最高，分別為21.94%和16.33%；汪亞玲等[7]對25例HIV合并MTB陽性病例進行耐藥性分析發現其耐藥率為16.00%。本研究中MTB總耐藥率為16.30%，與上述報道略有差異，這可能與研究方法不一致、不同地域傳染流行不太一致有關。

RFP通過與RNA聚合酶β亞單位結合，干擾、抑制mRNA的轉錄，從而達到殺菌的效果，rpoB基因突變使RNA聚合酶高度保守的氨基酸發生置換，進而阻止RFP的結合而導致耐藥。在MTB耐RFP分離株中，90%以上在所分析的rpoB基因不同部位存在多種突變，突變一般發生在rpoB 507～533位27個氨基酸密碼子(81 bp)組成的RFP耐藥決定區(RRDR)內。其中最常見的突變位點是531位的絲氨酸(Ser)(40%～60%)、526位的組氨酸(His)(30%～36%)、516位的天冬氨酸(Asp)(7%～9%)[8]。rpoB基因突變特征具有明顯的地域性差異，不同國家和地區RFP耐藥MTB的rpoB基因變異譜和變異率呈現出不同的特點，這可能與rpoB特定位點突變致耐RFP菌種在某一特定地域傳染流行有關，也可能與研究標本量少和抽樣方法不一致有關。本研究結果顯示，云南省HIV/MTB感染人群中RFP耐藥MTB的rpoB基因突變以RRDR-531(TCG→TTG，Ser→Leu)為主(66.7%)。國內外研究結果表明，531位密碼子突變一般導致高水平耐藥，與傳統藥敏試驗有較好的一致性，該突變作為RFP耐藥MTB診斷的分子標記靶點有較好的臨床應用價值。

MTB對INH的耐藥機制與katG、inhA和ahpC基因的啟動子缺失或突變有關，其中katG完全缺失或點突變是最主要的耐藥機制[9]。katG基因變異會導致其編碼產物過氧化氫-過氧化物酶的活性喪失或降低，使INH不能活化，從而不能攻擊分枝菌酸，導致MTB對INH耐藥[10]。inhA啟動子變異會增強烯酰基乙酰載體蛋白還原酶的表達，超過了藥物抑制作用，從而使菌株耐受INH[11]。katG基因中常見的突變率位點是315位(AGC→ACC，Ser→Thr)，發生率約為60.00%[8]。本研究中云南省HIV/MTB感染人群中INH耐藥MTB的katG基因突變以315位(AGC→ACC，Ser→Thr)為主(78.6%)，較60.00%略高，這可能與檢測人群不一致、不同地區菌株耐藥相關基因變異存在多態性，突變類型、位點、頻率各不相同有關。本研究中還檢出1例katG基因完全缺失，在MTB耐INH分離株中，有2%～10%的分離株發生katG基因完全缺失，而且主要出現在高度耐INH菌株中，故katG基因缺失對MTB耐INH有較好的指導意義。在MTB耐INH分離株中，10%～35%的分離株在inhA啟動子區域發生突變，最常見的突變位點是15位[8]。本研究中僅有2株耐藥菌檢出15位突變，原因可能是該基因耐藥株不是云南省HIV/MTB人群中流行的優勢耐藥菌株，或者此基因變異率不高，但尚需擴大標本量進行驗證。

綜上所述，本研究闡明了云南省HIV/MTB感染者中MTB耐RFP rpoB基因的主要突變位點為531(TCG→TTG)，耐INH katG、inhA基因的主要突變位點為katG基因315(AGC→ACC)，其作為耐多藥結核診斷的分子標記靶點有較好的臨床應用價值。