基于分子間裂分G-四鏈體-氯化血紅素DNA酶自組裝納米線的“Turn-on”型汞離子傳感研究*

張 何,趙智糧,傅 昕,王 青

(湖南工程學院化學化工學院,湖南 湘潭 411104)

汞是一種高毒性重金屬元素,可在水、空氣和土壤中進行遷移,并通過食物鏈進入人體。近幾年發現如果長期接觸Hg2+,可直接引起腦損傷、運動障礙、致畸、致癌和腎衰竭等疾病[1-2]。因此在防治汞污染的同時,快速、高效地檢測Hg2+技術具有重要的現實意義。目前比較成熟的汞檢測技術包括原子熒光光譜法,電化學法、冷原子吸收法、熒光光譜法等儀器方法[3-5],這些方法具有較好的特異性,準確性以及靈敏度,但是該類技術依靠大型儀器,費用昂貴,不宜進行現場實時檢測。利用生物傳感器[6-7]檢測Hg2+,主要根據胸腺嘧啶(T)特異性識別Hg2+,形成特殊的T-Hg2+-T結構[8-10]。Ono A等首次報道了利用DNA作為Hg2+的識別元件,在液相體系中高特異檢測Hg2+的新思路[11]。

DNA 酶(DNAzyme)是一種具有催化性能的DNA分子,因其易于復制和儲存、價格低廉、便于特殊標記和操作、不易水解且熱穩定性良好等優勢,使其在生物模擬酶的研究中占據極其重要的地位[12-13]。G-四鏈體-Hemin DNA 酶則是近些年來迅速發展起來的一種DNA酶[14-19],G-四鏈體是由富含鳥嘌呤堿基(G)的DNA 序列形成的一種特殊的DNA二級結構[20-21],當它們與氯化血紅素(Hemin)結合后,可以顯現出較強的過氧化物酶活性,能夠催化H2O2參與的一些反應[22-25]。目前,G-四鏈體-氯血紅素DNA 酶用于檢測的優勢得到了進一步的發現和鞏固,發展了多種生物傳感器[26-29]。近年來,將G-四鏈體-氯血紅素DNA 酶酶促信號放大與T-Hg2+-T特異性識別結合起來,發展了多種Hg2+檢測新方法[30-32],雖然這類傳感器彌補了傳統儀器分析方法的不足,但仍然存在信號放大方法單一、靈敏度不足等問題,在生物醫學樣品分析方面難以實現超靈敏Hg2+檢測。

目前廣泛用于提高生物傳感器靈敏度的核酸分子擴增技術主要包括環介導等溫擴增、滾環擴增、鏈置換擴增、聚合酶鏈式反應以及連接酶鏈式反應等[33-35],但這些技術依賴于DNA模板擴增,而擴增的模板序列增加了交叉污染的可能性,因此該類方法容易出現假陽性結果。雜交鏈式反應是2個DNA發夾之間的自組裝雜交反應,在引發DNA存在時,通過部分互補序列重疊成一個長的雙鏈DNA納米線(納米線定義為一種具有在橫向上被限制在100納米以下(縱向沒有限制)的一維結構,DNA雙螺旋結構的直徑為2 nm)。由于不需要擴增DNA模板、信號放大不需要酶參與、假陽性率低等特點,該方法已經與多種技術相結合用于發展新型、高效生物傳感器,如電化學方法測定核酸[36]、生物發光方法測定核酸[37]、熒光方法測定核酸[38]、G-四鏈體-血紅素DNA酶納米線測定核酸[27]、G-四鏈體-血紅素DNA酶納米線測定脂多糖[39]等技術,而且雜交鏈式反應還可以進一步應用于分子生物學、DNA診斷和臨床診斷。

本研究以聚苯乙烯微球為納米線自組裝界面,通過T-Hg2+-T特異性識別結構引發雜交鏈式反應,在微球界面上自行組裝具有串聯排列分子間裂分 G-四鏈體-血紅素DNA酶的DNA納米線,發展高靈敏的Hg2+“Turn on”檢測生物傳感器。該技術具有檢測靈敏度高,特異性好的特點,操作簡單,可用于現場檢測技術的發展。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

UV-1800紫外-可見分光光度計(日本島津儀器公司),手提式壓力蒸汽滅菌器(浙江新豐區醫療器械有限公司),真空干燥箱(北京市永光明醫療儀器有限公司),電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司),高速離心機(艾本德生命科學公司),超純水器(德國默克密理博公司),pH酸度計(杭州陸恒生物科技有限公司)。鏈霉親和素功能化的聚苯乙烯微球(直徑15.4 μm)購自美國Bangs Lab公司,氯化血紅素(Hemin)、2,2′-聯氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、二甲亞砜(DMSO)、4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)、HgCl2、Pb(NO)2、CdCl2、FeCl2及其他金屬離子均購自上海生工生物工程股份有限公司;牛血清白蛋白(BSA)購自上海華藍化學科技有限公司。DNA探針(表1)購自上海生工生物工程股份有限公司,并經HPLC純化。

表1 DNA探針序列

1.2 實驗過程

1.2.1 微球修飾

取100 μL鏈霉親和素修飾的微球(直徑為15.4 μm)于0.5 mL的滅菌離心管中,用100 μL的親和洗脫液(pH 7.5,20 mmol/L Tris-HCl,1 M NaCl,1 mmol/L EDTA,0.0005% Triton X-100)洗滌兩次,3 500 r/min離心分離后去上層清液。向微球中加入47 μL的親和洗脫液以及3 μL的Hg2+捕獲探針(10μM),混合均勻并37 ℃搖床孵育1 h。通過離心洗滌除去未結合的探針,加入100 μL親和洗脫液于4 ℃下保存備用。

1.2.2 汞離子比色分析

發夾探針P1和發夾探針P2分別加熱到95 ℃孵育,5 min后再緩慢(2 h內)冷卻到室溫以保證發夾結構的形成,使用前保存在4 ℃。移取5 μL功能化微球于滅菌離心管中,加入10 μL發夾探針P1和發夾探針P2的混合溶液(0.5 μmol/L),10 μL不同濃度的Hg2+,再加入160 μL 10 mmol/L HEPES buffer(pH 7.0,包含100 mmol/L NaNO3,25 mmol/L KNO3),37 ℃搖床孵育50 min。離心去上清,用HEPES buffer洗滌3次,最后加入100μL的HEPES buffer重新懸浮。加入6 μL 20 μM的hemin,避光下37 ℃孵育20 min,離心并用10 mmol/L HEPES buffer洗滌3次,除去多余的hemin。最后加入50 μL ABTS(4 mmol/L),和50 μL H2O2(4 mmol/L),在37 ℃條件下反應8 min,之后離心分離,取上層清液,進行吸收檢測。我們選擇420 nm處的吸光度作為測量值,定義ΔA420 nm=A420 nm-A0,其中A420 nm為樣品測量值,A0為Hg2+濃度為0時的背景值。

圖1 自組裝串聯DNA酶納米線傳感器檢測Hg2+原理圖

2 結果與討論

2.1 檢測原理

本研究借助分子間裂分G-四鏈體DNA酶的催化特性,在微球上構建一種檢測Hg2+的信號放大方法。首先在微球表面修飾富含T堿基的Hg2+捕獲探針,其5′端帶有生物素標記和C10延長鏈,通過生物素和鏈霉親和素的特異性結合,固定到鏈霉親和素修飾的微球表面。G-四鏈體的形成至少需要4組連續或相互靠近的GGG序列,發夾探針P1和發夾探針P2的序列一端都含有3組GGG重復序列,另一端含有一組GGG重復序列,但由于2個探針在形成莖環結構時一組GGG被包含在莖部區域,因此不能形成分子內G-四鏈體。檢測原理如圖1所示,在發夾探針P1、發夾探針P2及Hg2+存在時,Hg2+捕獲探針與發夾探針P1的3′端序列雜交并形成4個T-Hg2+-T結構,并將發夾探針P1的莖部打開釋放P1的5′端。發夾探針P1釋放的5′端序列與發夾探針P2的5′端序列反向完全互補并打開發夾探針P2的莖部結構,發夾探針P2釋放的3′端序列與發夾探針P1的3′端序列完全互補并打開發夾探針P1的莖部結構,釋放其5′端序列,如此周而復始,在微球表面形成DNA納米線。由于發夾探針P1、發夾探針P2的5′游離末端及3′游離末端都包含富G序列,而且在組裝的納米線上通過雜交鏈式反應相互拉近并折疊形成分子間裂分G-四鏈體,構建成含有串聯排列DNA酶的DNA納米線。在Hemin插入后顯示出明顯增強的類過氧化物酶的催化活性,該酶能催化H2O2與2,2′-聯氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)之間的反應產生綠色的陽離子自由基ABTS·+,在420 nm處存在最大吸收峰,其吸光值與反應體系中汞離子濃度的存在定量關系。

2.2 實驗條件的優化

為獲得優化的實驗結果,考察了功能化微球的使用量、Hemin濃度、修飾在微球上的Hg2+捕獲探針與發夾探針P1通過T-Hg2+-T配位結合的時間和溫度對Hg2+檢測的影響。

2.2.1 微球用量的選擇

微球為汞離子識別、雜交鏈式反應以及DNA酶催化反應提供了反應平臺,探針功能化的微球用量決定反應體系的靈敏度。如圖2(a)所示,加入反應體系的微球的量在5μL(5.06×103beads/μL)以下時,隨著微球量的增加,吸光值也相應提升,表明在此范圍內微球量的增加,捕獲的汞離子量也增加,形成了更多的DNA酶分子;當反應體系中微球的量大于5 μL的時候,吸光度不再隨微球的量增加而增加,說明體系中微球的量已達到飽和。由此可見,該檢測體系中微球的最適用量為5 μL,即25.3×103beads為最合適的加入量。

2.2.2 Hemin濃度的選擇

向形成串聯排列G-四鏈體DNA納米線溶液中加入Hemin后,Hemin會插入G-四鏈體形成具有過氧化物酶活性的G-四鏈體-氯血紅素-DNA酶,但由于游離的Hemin也具有一定的過氧化物酶催化活性,所以Hemin的濃度可能會對傳感器的靈敏度產生影響。結果如圖2(b)所示,Hemin的最佳濃度為20 μmol/L。當Hemin的濃度在20 μmol/L以下時,信號值(ΔA420 nm)隨著Hemin濃度的增加而增加;當Hemin的濃度過高時,其背景信號也相應增強,所以信號值反而隨之下降。因此反應體系中Hemin的最佳濃度為20 μmol/L。

圖2 Hg2+濃度響應信號(ΔA420 nm)影響因素的實驗優化

2.2.3 Hg2+捕獲時間和溫度的選擇

修飾在微球上的Hg2+捕獲探針包含多個T堿基,需要Hg2+參與配位與發夾探針P1的富T序列結合,其結合效率直接影響檢測的靈敏度。考察了Hg2+捕獲時間為10 min～80 min時對檢測性能的影響,結果如圖2(c)所示,當反應時間從10 min增加到50 min時,反應體系的ΔA420 nm增加,說明隨著時間的延長,G-四鏈體DNA酶的組裝量增加,催化性能增強,反應時間達到50 min時體系的ΔA420 nm達到最大,隨后并不隨著時間的延長而增加,說明此時Hg2+的捕獲趨于飽和,所以選擇50 min作為Hg2+的捕獲時間。對Hg2+捕獲的最適溫度進行了考察,選擇的溫度范圍為:5 ℃～45 ℃,結果如圖2(d)所示,隨著反應溫度的升高,反應體系ΔA420 nm相應增加,在37 ℃時達到最高,隨后隨著溫度的升高,信號值開始下降。

圖3 Hg2+檢測的選擇性分析

2.3 Hg2+的選擇性分析

為檢測傳感體系對Hg2+檢測的選擇性,實驗選擇了9種常見的金屬離子(Zn2+、Pb2+、Mg2+、Ni2+、Fe2+、Cd2+、Ca2+、Mn2+、Co2+)作為共存離子,并分別檢驗了它們對Hg2+檢測的干擾程度。結果如圖3所示,在最優條件下反應,未加任何離子的反應體系(空白對照)吸光值與分別加入不同干擾離子的反應體系吸光值相差不大(柱狀圖灰色表示),表明該生物傳感器對以上9種離子并不體現出選擇性;另外Hg2+與其他金屬離子共存時(共存離子的濃度與汞離子的濃度之比為100∶1),向反應體系中同時加入1 nmol/L的汞離子和上述100 nmol/L其他金屬共存離子,空白對照中只加入1 nmol/L的汞離子,發現各組吸光值與空白對照吸光值相差不大(柱狀圖白色表示),相對誤差在-2.8%～1.7%之間,結果表明以上9中金屬離子對汞離子的干擾性很小。同時,通過空白組也可看出,設計的生物傳感器對汞離子具有高選擇性。

圖4 (a)Hg2+濃度在2 pmol/L～10 nmol/L范圍內的 校正曲線;(b)檢測Hg2+的線性范圍

2.4 Hg2+的定量檢測

與其他汞離子分析方法相比較,如:基于金納米顆粒修飾的絲網印刷電極免標記檢測尿液中汞離子(檢出限2 500 pmol/L)[40]、電感耦合等離子體質譜檢測尿液和血液中汞離子(檢出限847 pmol/L)[41]、基于DNAzyme/ABTS-H2O2體系的尿液中Hg2+比色傳感器(檢出限2 000 pmol/L)[32]、基于核酸外切酶I輔助的尿液中Hg2+熒光傳感器(檢出限1 500 pmol/L)[42],本方法檢測尿液中汞離子(檢出限1.5 pmol/L),具有較高檢測靈敏度。這主要歸因于三重信號提升方式:微球反應界面導致減少的背景干擾及信號提高、雜交鏈式反應形成串聯排列分子間裂分G-四鏈體-血紅素DNA酶的DNA納米線以及 G-四鏈體-血紅素DNA酶的酶促催化信號放大。

2.5 實際樣品分析

為考察該方法用于實際樣品中Hg2+檢測的性能,人體尿液為檢測對象構建檢測體系。實驗采用加標法,向離心管中加入4 μL的本底尿液,然后加入不同濃度的汞離子溶液,反應溶液中的汞離子濃度分別為15 pmol/L、20 pmol/L、50 pmol/L。結果如表2所示,檢測尿液樣品的平均回收率為97.6%～103.7%之間,RSD在1.7%～3.1%之間;說明設計的傳感器可用于尿液樣本中的汞離子檢測,具有較好的準確度。

表2 實際樣品檢測

3 結論

本研究以聚苯乙烯微球為納米線組裝界面,通過T-Hg2+-T特異性識別結構引發雜交鏈式反應,在微球界面上自行組裝具有串聯排列分子間裂分G-四鏈體-血紅素DNA酶的DNA納米線,發展了一種高靈敏的Hg2+“Turn on”檢測生物傳感器。微球的引入極大的增強了傳感器的抗干擾能力,降低了背景信號,實現了人體尿液中Hg2+的快速檢測。本方法操作簡單、靈敏度高、特異性好,適合發展為環境監測現場實時分析技術,未來亦可能成為醫學界檢測汞離子的手段。