面向電阻抗成像檢測的多電極陣列微流控芯片設計*

范大勇,姚佳烽,劉彬彬,徐梓菲

(1.東南大學建筑設計研究院有限公司,南京 210096;2.南京航空航天大學機電學院,南京 210016)

近年來,隨著精密加工技術越來越成熟,應用于生物醫學檢測的微流控芯片也開始快速發展,為細胞的檢測提供了新思路[1]。目前應用在細胞檢測的方法包括免疫熒光法、細胞的電化學分析法、單細胞質譜分析法等。免疫熒光法通過測定熒光物質發射的熒光強弱來定量分析,該方法具有靈敏度高、選擇性高等優點,但是檢測前需要對細胞進行標記[2],從而會影響細胞的機能。細胞的電化學分析法通過分析細胞在溶液中的電化學性質來分析溶液中細胞的種類,但是不能得到細胞的位置信息。單細胞質譜分析法是通過對細胞在離子源中產生的離子束分析,可以確定細胞的質量,但是檢測速度低[3]。電阻抗成像檢測技術相比于其他幾種細胞檢測技方法,不但可以快速的檢測細胞的種類和位置,還具有非侵入免標記的優點。

細胞在電檢測中得到的電阻抗包含電阻和電容兩種成分,并且不同種類的細胞包含不同的阻抗信息[4]。電阻抗成像技術是利用了測量場域內部電導率的差異來進行成像[5]。其基本方法為通過被測量場域表面的電極對注入安全的交流電流,測量其余電極對在該交流電場內的交流電壓,之后利用成像算法通過測量值來重構場域內部電導率分布圖像。由于輸入電流的電流值以及頻率范圍是安全的,且得益于目前計算機速度的飛速發展,故電阻抗成像檢測技術具有安全無輻射、成像速度快等優點,是一種新興的細胞檢測技術[6],并擁有廣闊的研發前景。由于微尺度下電阻抗成像檢測設備尺寸小且加工不易,噪聲對電極采集的信號具有較大影響,所以對微尺度電阻抗成像檢測芯片的設計還很少。Yang Y等[7]開發出了直徑15 mm的微流控芯片,由16個電極組成電極陣列,可以對培養皿中的細胞進行三維實時成像,而且該設備也可用于對人體組織的檢測。Sun等[8]采用PCB技術開發出直徑4 mm的微流控芯片,可以對單細進行胞成像。然而由于結構限制,這些設備都不支持流動狀態下的細胞檢測。

本文設計一種用于可流動狀態下細胞電阻抗成像檢測的多電極陣列微流控芯片。該芯片可以對靜止狀態下的細胞和流動狀態下的細胞進行電阻抗成像檢測。仿真軟件模擬結果顯示,電極對內部細胞的位置變化比較敏感,可以通過電極所測量的電壓變化計算出細胞的空間分布。

1 多電極陣列微流控芯片的結構設計

電極陣列作為微流控芯片的核心,要根據使用環境設計適宜的尺寸及結構。本文設計的多電極陣列微流控芯片需要考慮如下方面:微流控芯片要保持內部多相流的流動性以滿足不同細胞的混合;實現多個截面的電阻抗成像檢測;芯片與測量儀器接口的設計;芯片的固定。

圖1 多電極陣列微流控芯片外觀示意圖

微流控芯片的整體結構如圖1所示,包括PCB板、集成陣列電極的微流道及接口等。芯片通道入口選用“Y”型,方便不同種類細胞的混合和分離。芯片主通道上分布3個多電極陣列截面,用于主通道內部的電阻抗成像檢測。PCB板中印刷了芯片所需的電路,電極通過分布在PCB板兩側的插針接口與其他儀器進行信號傳輸,芯片的基板則通過螺釘和固定板固定在PCB板中。

1.1 微流體通道整體設計

微通道是芯片的核心,微通道結構決定了通道內流體的運動[9]。微通道包含流體出入口、備用出入口、主輔通道等。以細胞的分離和檢測為例,細胞液和懸浮液分別從不同的入口注入主通道,經過主通道檢測和分離后不同種類的細胞液從不同的出口流出。

本著簡單微加工方法和實際運用操作可行的原則,以及滿足不同種類細胞混合的要求。本文設計的微流體通道的入口和出口設計成“Y”型,結構如圖2所示。芯片的整體長度為L3=20 mm,寬度W=10 mm。主通道借助四路支路通道達到與樣品池關聯的目的。細胞液及懸浮液分別經過入口A和入口B進入,在主通道處理之后,不同種液體分別從出口C、D流出。支路通道A、B、C、D的直徑相同為100 μm,長度為L1=3 mm。電極位于主通道的側壁上,每個電極截面間距S=3 mm。主通道的長度為L2=10 mm。

圖2 微通道平面的CAD設計圖(單位:mm)

1.2 微流體通道橫截面設計

微通道要保持內部多相流的流動狀態為層流,實現細胞在微通道中的有序排布。在粘性力遠大于慣性力,或者雷諾數Re≤2 300時處于層流狀態。在微通道中處于層流狀態下的流體可以借助N-S方程得知流體壓力損失情況。雷諾數方程和N-S方程具體公式為:

Re=ρvd/μ

(1)

式中:ρ和μ分別為流體密度和動力粘性系數(N·s/m2),v和d分別為流場的特征速度(m/s)和特征長度。從式(1)得知,通道特征長度d越小,雷諾數Re越小。

在宏觀流體運動學中,常借助比表面積對流體流動性進行衡量。對于型腔截面形狀來說,比表面積表示的是型腔表面積與體積的比值。在微尺度通道之中,對于長度一致的微流道來說,比表面積衡量的是截面周長比截面面積。如圖3所示,橫截面為圓形的流道的比表面積為40 mm-1,橫截面為菱形的流道的比表面積為56.56 mm-1。由于微流體中流動長度與比表面積表現出了反比關系[10],圓形相比于菱形具有更小的比表面積,其流動長度更大。所以,可以選擇截面為圓形的微流道。微流體相比于宏觀狀態下的流體,在進行流動時有微尺度效應,該效應使得微流體表面力效用增強,黏性力比慣性力大很多。因此有利于微通道內流體保持層流狀態,便于實現細胞的介電泳分離。

電阻抗成像中圖像重構時,電極采集數據的精度影響圖像重構的質量。微通道截面電極不同的結構、數量和排布方式會產生不同的電勢分布。先前的研究考慮到微流控芯片的加工工藝,電極排布到菱形微通道的兩側(圖3(a)),這種排布方式中利用8個電極實現了電阻抗成像檢測[11]。本研究采用圓形橫截面,電極數目為8電極、12電極與16電極,電極的排布方式及尺寸如圖3(b)所示。

圖3 微通道不同截面形狀及尺寸(單位:mm)

1.3 電極和芯片材料選擇

微電極是微流控芯片的核心部件,通過電信號來檢測細胞的阻抗,以及通過施加電壓之后所產生的電場來操控細胞的運動。由于電極對于電場的靈敏性要求很高,所以其導電特性對于內電場大小及分布有很大的影響[12]。在生物監測的微流控芯片設計上,電極在選擇時需要考慮:導電性能、抗腐蝕性能、加工工藝以及生物相容性。通過對各種常見的電極材料比較,最佳的材料是鉑金(Pt),主要是由于其具有延展性好、熔點高、導熱導電性能好、化學性質極其穩定、不溶于強酸強堿以及具有獨特的催化作用,符合微流控芯片電極的設計要求。

微流控芯片的流道部分可以使用的材料比較多。例如玻璃、單晶硅、石英及有機聚合物等。考慮到芯片需要耐高溫、抗化學反映、流道的疏水性以及極低的電導率。對能夠使用的各種材料進行了對比得知,聚二甲基硅氧烷(PDMS)不僅滿足以上所有要求,同時還具有高分子材料的優勢,不會有永久性破壞,與芯片材料的要求非常一致;同時可以實現與自身及硅等材料的可逆結合。本文選取PDMS為芯片制作材料。

1.4 芯片加工方法

選用PDMS作為微流控芯片材料,制作當中可以采用的技術非常多。例如熱壓成型法、模塑法及刻蝕法等。熱壓成型法是指在加熱并同時加壓的條件下,使材料成型并燒結成制品。特點是工藝成熟,可以得到致密度很高的制品,但不適合于制作微流控芯片內部的多電極陣列?？涛g法是指按照設計要求對材料表面進行選擇性腐蝕或剝離,具有分辨率高的優點。模塑法首先借助多種技術(例如刻蝕法)加工出陽膜,之后進行高分子聚合物的澆筑和固化,再把材料剖離就得到我們想要的芯片。本文采用模塑法分層加工芯片,自下而上根據每層所需的PDMS和Pt加工出完成的芯片,借助該方法能夠完成相鄰通道距離僅僅為0.3 μm的結果。這種方法制作簡單,能夠進行批量制作、成本低、周期短且對環境沒有特殊要求。

2 芯片設計仿真分析

2.1 仿真條件和算法

由上文分析可知,微流道的設計重點在于橫截面內電極排布的設計,故對該包含電極的橫截面建立仿真模型并進行優化分析。仿真模型主要包括通道、電極、細胞及蒸餾水4個部分。用一個直徑為D3=10 μm的圓來代替細胞,其電導率為σ細胞=10-3S/m,相對介電常數為ε細胞=83。電極材料為鉑金(Pt),電導率σ電極=8.9×106S/m,分布在通道兩側,通道溶液材料設置為蒸餾水,電導率σ水=5.5×10-6S/m,相對介電常數為ε水=78。在仿真過程中分別針對8電極、12電極、16電極以及菱形8電極進行仿真計算。電極等間距分布在微通道的邊界上,對相鄰電極施加激勵電壓U=1 V,同時采集相鄰電極之間的電位差。

根據麥克斯韋方程和電磁場理論,對假設仿真模型內部敏感場為似穩場且內部沒有激勵源。在檢測區域內無電流源存在,則敏感場的數學模型為:

·J=0

(2)

場域內電阻率分布σ與電位分布Ф所滿足的微分方程為:

·(σФ)=0

(3)

敏感場滿足邊值條件:

σ?Ф/?n=J

(4)

Φ=Φ0

(5)

式中:J為邊界上外加激勵的電流密度,無注入電流時為零;n為場域外法向單位向量;Φ0為邊界上的電位。

圖像重建算法作為EIT逆問題求解的核心問題被廣泛研究,在此次仿真計算中采用廣義矢量模式匹配法(GVSPM)經行圖像重建。該算法的表達式如下:

(6)

式中σk是第k次迭代計算后獲得的電導率,J是雅可比矩陣,U是仿真模型中電極電位進行正規化后的值。

2.2 仿真結果分析

對應圖3設計出來的幾種橫截面,采用計算機仿真方法進行了細胞檢測能力對比。在仿真過程中,對3個細胞組成的細胞群穿過微通道時,微通道內截面進行仿真分析。圖4為不同電極傳感器仿真模型圖與通過廣義矢量模式匹配法(GVSPM)圖像重構算法經行圖像重建之后的結果圖的比較。亮色代表高電導率的細胞群,暗色部分代表的是低電導率的蒸餾水。

圖4 圖像重建模型和仿真結果

為了對仿真結果與仿真模型之間的相關性定量分析,本文引進參數:圖像相關性IC

(7)

相鄰電極激勵模式能夠在相同電極數目的情況下獲得更多的獨立數據,但是激勵電流主要分布管道邊緣,管道邊緣成像分辨率較高,管道中心部分成像分辨率較低。與圓形管道相比,在相同電極數時,電極均勻分布在菱形管道邊緣會使得細胞群位置更靠近管道邊緣,提升管道中心部分成像質量。但是當細胞群位置靠經菱形管道邊角時,電位分布不規律,成像質量會迅速下滑。在圖5中,圓形管道傳感器所得圖像相關性隨著細胞群中心與管道中心距離的增加而增加。菱形傳感器D-8成像質量不穩定,當細胞群位置靠近電極時,成像質量嚴重下降。細胞群中心位置在變化過程中,不同電極傳感器得到的圖像重建質量各有優劣,16電極傳感器成像圖像相關性的平均值以及極差要優于8電極和12電極傳感器。

圖5 不同電極傳感器圖像相關性與細胞群 中心位置的關系

圖6給出的是細胞群中心在相同位置處,不同電極傳感器圖像相關性的比較。圖6(a)為細胞群中心位于管道中心位置時,圓形12電極傳感器成像質量優于其他類型電極傳感器。對于圓形管道截面,當電極數目增加時,能夠采集更多的測量數據,從而提高圖像重建質量。電極數目的增加也會擴大有用信號的動態范圍,在測量精度和計算次數一定時會使成像質量下降,成像效果會隨模型位置的不同在更大的范圍內變化。圖6(b)為細胞群中心距管道中心距離0.01 mm處,不同傳感器成像的圖像相關性比較。在選定的兩個位置處,菱形8電極傳感器成像質量都要優于圓形8電極傳感器。圓形傳感器的成像質量隨著電極數目的增多逐漸增強,16電極傳感器成像質量會高于8電極和12電極傳感器。圖6(c)為細胞群中心距離管道中心0.02 mm處成像質量的比較,此處各電極傳感器成像的圖像相關性較為接近。圖6(d)為細胞群中心距離管道中心0.035 mm處成像質量的比較,菱形8電極傳感器成像質量嚴重下降,說明菱形電極傳感器成像質量不穩定。由于微流控芯片不僅用于成像,還用于細胞的分離,在細胞的分離過程中細胞逐漸趨近微流道內壁。微流道內壁部分成像質量相比于其他位置成像質量更加重要,結合電極傳感器成像圖像相關性的平均值分析。圓形電極傳感器中,16電極傳感器成像質量普遍優于8電極傳感器和12電極傳感器。

圖6 不同電極傳感器在相同細胞群中心 位置時的圖像相關性

電極越多,可以增加分辨率,提高成像質量。由于受空間限制,過多的電極導致又導致電極尺寸的減小,導致兩電極間采集的信號微弱,減低了信號的敏感性,同時,過多電極也會大大降低采用速率,導致成像速度慢。因此,本文設計的微流控芯片傳感器選用圓形橫截面16電極傳感器。

設計出來的16電極陣列微流控芯片突破了傳統微流路尺寸的設計技術限制,能夠將多電極陣列于流路周圍,擴大了微流路的管道直徑,不僅能夠實現電阻抗成像檢測嗎,而且在細胞分離方面,可以充分利用介電泳力,在不減少介電泳力(Dielectrophoretic force)的條件下增大了細胞的流動量,大大提高了細胞的分離速度。

3 結論

微流控芯片中電阻抗成像不僅可以觀察到細胞的分布,還可以對細胞分離起著指導作用。本文設計了一種用于實現細胞電阻抗成像檢測的多電極陣列微流控芯片,并采用數值仿真方法對設計出來的微流控芯片進行了對比分析,并得到了最優方案。具體結論如下:

①對微流控芯片進行整體設計,采用嵌入8,12和16電極的圓形橫截面,并與菱形橫截面進行了對比討論。

②在芯片材料選擇上主要考慮透光性、生物兼容性、加工工藝等因素,綜合各種因素,最后選擇了采用PDMS制作芯片。在電極材料選擇上主要考慮導電性能、抗腐蝕性能、加工工藝等因素,最終選擇物理和化學性能都很穩定的鉑金(Pt)。

③運用數值計算方法建立了微流道內細胞群模型,并對主通道橫截面內的電場分布進行了計算,對不同的細胞位置在不同類型的電極橫截面中成像質量進行了對比分析。最終選擇含有16電極的圓形橫截面微流控芯片作為最優結構。

該研究對大流量細胞分離和檢測微流控芯片的設計提供了思路與一定的理論參考,可以實現3D微尺度細胞電阻抗成像檢測與特異細胞的介電泳分離。