脊髓灰質炎IgG抗體檢測試劑參考品的制備及標定

譚振國 楊蓉 羅芳宇

[摘要] 目的 建立脊髓灰質炎IgG抗體檢測試劑參考品，為脊髓灰質炎IgG抗體檢測試劑盒的性能評價提供可靠的質控品。 方法 通過中和實驗對血清進行確認，獲得了符合要求的血清，每個型別參考品有22份樣品，包含10份陽性參考品、10份陰性參考品、1份最低檢出量參考品、1份精密性參考品。 結果 脊灰病毒IgG抗體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型陰性參考品符合率均不低于9/10，陽性參考品符合率均不低于8/10，精密性參考品變異系數均不高于15%，最低檢出量參考品均不低于1∶8；參考品37℃放置5 d，反復凍融5次后穩定性良好。 結論 制備的脊髓灰質炎IgG抗體檢測試劑參考品經各項試驗檢測結果合格，可用于脊髓灰質炎IgG抗體檢測試劑的質控。

[關鍵詞] 脊髓灰質炎IgG抗體；參考品；質量控制；標定

[中圖分類號] R373.22 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）09（a）-0021-04

[Abstract] Objective Referance products were developed for assay kit of IgG of poliomyelitis to make it possible to reliably control quality of the assay kits in evaluating their properties. Methods Serum was confirmed through a neutralization test to obtain the serum which met requirements. Twenty-two samples were collected for each type of reference products， including 10 positive reference products， 10 negative ones， 1 reference product with the minimum detection limit and 1 precise reference product. Results The conformity ratio of type Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ negative reference products of IgG of poliomyelitis was not below 9/10. The conformity ratio of positive reference products was not lower than 8/10， the coefficient of variation of precise reference was not higher than 15%， and the coefficient of variation of precise reference products was not lower than 1/8. The reference products were placed at 37℃ for 5 days. They were still quite stable after 5 repetitive freezing and thawing. Conclusion The prepared reference products of assay kit for IgG of poliomyelitis were tested to be qualified in all tests and could be used for quality control over such assay kits.

[Key words] Polio IgG antibody； Reference； Quality control； Characterization

脊髓灰質炎是由脊髓灰質炎病毒所造成的傳染性極強的疾病，無特效治療方法，但可通過疫苗預防。盡管20世紀50年代以來就有有效的脊灰疫苗，在20世紀80年代前，每年仍有>35萬兒童因脊髓灰質炎而麻痹。因此世界衛生組織（WHO）1988年發起全球消滅脊髓灰質炎的倡議。到1999年，脊髓灰質炎病例已減少了99%，但全球仍未能實現消滅脊髓灰質炎的目標[1]。目前脊髓灰質炎病毒在巴基斯坦、阿富汗、尼日利亞和印度仍有傳播[2-3]，使我國脊髓灰質炎野病毒（wild polio virus，WPV）輸入性風險持續存在，2011年，我國新疆維吾爾自治區發生了由巴基斯坦輸入的WPV引起的暴發疫情[4-7]。全球消滅脊髓灰質炎形勢不容樂觀，尤其是與我國相鄰國家脊髓灰質炎疫情呈高發態勢，我國發生WPV輸入的風險增大[8-9]。隨著WHO消滅脊髓灰質炎進程的實施，全球首劑Sabin株脊髓灰質炎滅活疫苗（IPV）在昆明生物所研制成功，IPV的生產已成為防控脊髓灰質炎感染流行、保持人群高免疫水平并最終消滅脊髓灰質炎的關鍵[10]。無論疫苗的效力實驗，還是疫苗免疫效果評價都會進行抗體的檢測，而脊髓灰質炎病毒抗體參考品的建立目前沒有報道，因此，有必要建立脊髓灰質炎病毒IgG抗體參考品對脊髓灰質炎病毒IgG抗體檢測試劑的質量進行規范。在此前提下，本實驗室制備及標定了三套分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰質炎病毒抗體檢測試劑的參考品，用于不同型別脊髓灰質炎病毒IgG抗體檢測試劑的質控，現將結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 參考品的組成

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型參考品均包含10份陽參、10份陰參、1份最低檢出量參考品、1份精密性參考品。

1.2 試劑

本實驗室制備的脊髓灰質炎IgG抗體檢測試劑盒（批號：20170901）。

1.3 儀器

離心機，水浴鍋，隔水式恒溫培養箱，二氧化碳培養箱，酶標儀。

1.4 中和抗體實驗

待測樣品（1∶4稀釋）經56℃滅活30 min后，加至96孔板中，50 μL/孔，作2倍系列稀釋后，分別與100 CCID50的IPV病毒懸液于37℃中和2 h；加入（2～3）×105個/mL的Hep-2細胞懸液，100 μL/孔，置37℃、5%CO2培養箱中培養7 d。將能抑制50%細胞病變的最高稀釋度定為IPV抗體的中和效價，并以稀釋倍數的倒數表示。每次試驗均設病毒回滴試驗，回滴結果在32～320 CCID50/孔時，試驗判為成立。以中和效價≥8判為中和抗體陽性。

1.5 酶聯免疫吸附測定（ELISA）競爭法

標化參考品使用本實驗室制備的脊髓灰質炎IgG抗體檢測試劑盒（ELISA法）檢測，最低檢出量參考品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型均以1∶2、1∶4、1∶8及1∶16，在板上作2倍系列稀釋；每型別陰參10份，每份1孔；陽參10孔，每份1孔；每型別精密性參考品1份，連加10孔。待測樣品20 μL/孔，設陰性3孔、陽性2孔、空白1孔，各型待標參考品分別加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型抗原檢測板中，再分別加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型IPV-HRP，90 μL/孔，37℃保溫2 h；0.01 mol/L PBST洗板5次，TMB 37℃顯色10 min終止反應。在450 nm波長處測量樣品吸光度值（A值）。

1.6 穩定性試驗

1.6.1 熱穩定性試驗 將3套參考品37℃放置3、5 d后（37℃放置1 d，取出檢測）。

1.6.2 凍融試驗 將3套參考品反復凍融3、5次后，取出檢測。

2 結果

2.1 中和實驗制備參考品

2.1.1 陽性參考品 經中和試驗確認脊髓灰質炎病毒抗體陽性，人血清（HS）以每名患者的雙份血清均可中和脊髓灰質炎病毒，HS抗體效價為1∶8～1∶256，選取高中低不同效價的HS制備成4份陽性參考品，因無法篩到單型別抗體陽性樣品，故HS均為三價中和抗體陽性，抗體編號為HS1～HS4，3個型別陽參1～陽參4為相同效價血清；檢測不同型別牛血清（CS）和兔血清（RS）的效價，稀釋成高中低不同效價的6份陽性參考品，各型陽參編號見表1。各型別10份陽參2次中和實驗檢測均為陽性。

2.1.2 陰性參考品 經中和實驗確認脊髓灰質炎病毒抗體陰性，HS以每名患者的雙份血清均不能完全中和脊髓灰質炎病毒，抗體效價<1∶8，制備成6份陰性參考品，編號為HS5～HS10，各型前6份陰參均相同；選取其他型別的CS和RS作為4份陰性參考品，各型陰參編號見表2。各型別10份陰參2次中和實驗檢測均為陰性。

2.1.3 最低檢出量參考品 各型中選取1份2次中和抗體為陽性的血清，經1∶2、1∶4、1∶8及1∶16倍比稀釋作為最低檢出限參考品。

2.1.4 精密性參考品 各型中選取1份2次中和抗體為陽性的血清稀釋后作為精密性參考品。

2.2 ELISA法標定參考品

2.2.1 陽性參考品標定結果 使用3批次脊髓灰質炎病毒抗體檢測試劑、9人次對10份陽性參考品進行檢測，Ⅰ型陽性參考品符合率為94.4%，Ⅱ型陽性參考品符合率為90.0%，Ⅲ型陽性參考品符合率為97.8%。見表3。

2.2.2 陰性參考品標定結果 3批9人次對陰性參考品進行檢測，10份陰性參考品符合率為100%。見表4。

2.2.3 最低檢出量參考品標定結果 3批9人次對最低檢出量參考品進行檢測，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型最低檢出量參考品9次檢測值均在1∶8～1∶32。見表5。

2.2.4 精密性參考品標定結果 檢測試劑的精密度用變異系數（CV）來衡量。在板上連加10孔精密性參考品，其CV=標準差（SD）/平均值（x）×100%。9人次檢測結果顯示（表6），Ⅰ型精密度參考品CV值在2.56%～8.14%之間，平均5.64%；Ⅱ型精密度參考品CV值在2.71%～9.24%之間，平均5.21%；Ⅲ型精密度參考品CV值在3.48%～11.24%之間，平均6.37%。各批次CV值均<15%，符合檢測試劑對精密度的要求。

2.2.5 穩定性試驗結果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型待標參考品在37℃加速破壞試驗或凍融試驗后，實驗結果見表7～9。各型參考品：10份陽參均>9/10，10份陰參均為陰性，精密性參考品的CV值均<15%，各型最低檢出參考品均不低于1∶8。

3 討論

生物制品中的標準物質是一種由不同時間、不用地點、不同條件、不同操作者得出相對一致性結果的工具。因此，標準物質作為生物制品生產檢定中必不可少的重要組成部分，在生物制品質量控制和效力評價中發揮重要作用[11]。

診斷試劑參考品一般從靈敏性、特異性、精確性、穩定性四個方面進行考察[12]。使用陰陽性參考品對診斷試劑的特異性進行評價，本實驗中的陽性參考品由脊髓灰質炎中和抗體陽性的血清組成，由于HS無法篩到僅單個型別抗體陽性的血清，因而3個型別的陽參1～4均為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型抗體均為陽性且效價不同的人血清HS1～HS4，其他6份陽參為本型別高中低不同效價的CS和RS組成。其目的在于高濃度的陽參用于防止抗體濃度過高引起前帶效應的存在，而使檢測出假陰性；低濃度的陽參是用于防止弱陽性樣品漏檢而設置。陰參由6份脊髓灰質炎病毒中和抗體陰性的HS1～HS6和其他型別抗體陽性的CS、RS組成，用于防止假陽性的檢出和是否存在型間交叉。

標定出的最低檢出量參考品的含量可對診斷試劑的靈敏度進行評價，在檢測過程中可以監測試劑盒的檢測下限是否符合要求。

根據國家藥典對診斷試劑的要求，用于酶聯診斷試劑的精密度（CV）應不高于15%（n = 10）[13]。本次標定的精密性參考品選取檢中和抗體陽性、酶標檢測A值在0.6～0.8之間的樣品來控制檢測試劑的孔間差。

穩定性是標準物質的特性量值隨時間變化的性質，即在規定的時間間隔和環境條件下，標準物質的特性量值報紙在規定范圍的性質[14]。考慮到參考品在保存、使用、運輸過程中可能出現的情況，本研究設計了37℃加速破壞試驗和凍融試驗對參考品的穩定性進行考察。實驗結果顯示，37℃放置5 d或凍融3次仍可達到質控參考品的合格標準，通過分別使用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰質炎IgG抗體檢測試劑對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型抗體參考品進行檢測，結果均符合參考品的質量要求。

脊髓灰質炎病毒IgG抗體的水平對脊髓灰質炎病毒的血清流行病學調查和疫苗的免疫效果評價具有重要意義[15]。檢測脊髓灰質炎抗體的方法主要有經典的中和抗體實驗和ELISA法。微量細胞病變法是腸道病毒中和抗體檢測的“金標準”，在脊髓灰質炎病毒和EV71中和抗體檢測中均得到普遍應用[16-20]，但此方法檢測過程較繁瑣，檢測周期長，檢測結果影響因素較多。用ELISA法檢測抗體則操作簡便，不需要特殊儀器，3～5 h即可出結果而更具有廣泛的實用前景，但目前所報道的脊髓灰質炎抗體ELISA檢測方法僅能檢測單一種屬的抗體，而脊髓灰質炎病毒的血清學調查檢測的是HS，疫苗的效力實驗檢測是動物血清，制備脊髓灰質炎抗體也需要對動物血清進行檢測，沒有一種既能檢測HS又能檢測動物血清的脊髓灰質炎病毒IgG抗體檢測方法。因此，制備出針相應的脊髓灰質炎病毒IgG抗體診斷試劑的參考品勢在必行，脊髓灰質炎病毒抗體檢測參考品的研制，可以為今后可檢測不同種屬的脊髓灰質炎病毒IgG抗體診斷試劑的研發及質量控制提供必要的保證。用中和抗體檢測的方法制備出3套針對脊髓灰質炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型抗體檢測的參考品，并且在中國醫學科學院北京協和醫學院醫學生物學研究所（以下簡稱“我所”）制備脊髓灰質炎病毒IgG抗體檢測試劑上進行標化，并確定了參考品的質量標準：陰性參考品符合率不低于9/10，陽性參考品符合率不低于8/10，精密性參考品變異系數不高于15%，最低檢出量參考品不低于1∶8。

綜上所述，由我所制備的脊髓灰質炎IgG抗體的3個型別的參考品是成功的，不僅可以對我所制備的脊髓灰質炎病毒IgG抗體診斷試劑質量控制起到重要作用，也為其他廠家研發檢測不同種屬的脊髓灰質炎病毒IgG抗體診斷試劑提供了必要的質量參考。

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（收稿日期：2018-02-06 本文編輯：張瑜杰）