高通量測序技術在腸道微生物宏基因組學研究中的應用

孫鳳春 王微 王靖

【摘要】用宏基因組技術研究不同比例鋸末牛糞堆肥產物中微生物的組成和分布。結果表明，牛糞與鋸末質量比為2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1的3個堆肥樣本中微生物可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）有較大的差異，其中含量最高的3個門的微生物為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，在不同樣本中它們的含量也有較大差異。從屬水平分析，含量最高的是甲基單胞菌屬、噬氫菌屬、固氮菌屬和寡養單胞菌等營養轉化和合成的菌屬。降解纖維素和木質素的也有一定的含量，特別是假單胞菌屬含量較高。經過對堆肥產物基本性質及其微生物的分析發現，當牛糞與鋸末的比例為2 ∶1時，堆肥樣品中的營養轉化和合成菌屬以及去除污染菌屬都高于其他2個樣品，堆肥效果較好。

【關鍵詞】牛糞堆肥；宏基因組；微生物；鋸末；可操作分類單元（OUT）；分子生態學依據

【中圖分類號】R181.3+2 【文獻標識碼】B 【文章編號】2095-6851（2018）10-051-02

近年來，由于產業結構調整，我國規模化養殖業發展迅速。以生產牛奶為主的奶牛養殖業產生了可觀的經濟效益，但是同時也帶來了大量的牛糞等固體有機廢棄物，為了保護環境、實現養殖業的可持續發展，必須進行牛糞的無害化處理和資源化利用，堆肥處理是目前有機固體廢物處理的重要方式。堆肥的本質是微生物群落結構演替協同作用于堆肥基質的生化過程。在細菌和真菌等微生物的作用下，降解有機物，殺死病原菌，促進有機質穩定化和腐殖化，最終達到無害化和資源化的目的，并生成大量可被植物吸收利用的有效態氮、有效態磷、有效態鉀化合物和其他有機物質作為土壤肥力活性物質。因此，研究微生物的群落結構對于了解微生物的協同關系、調控堆肥以及研究高效穩定的復合菌系都有重要意義。堆肥過程中的微生物菌系復雜，變化較大，而且其中大多數菌系不能分離培養，因而常規的試驗方法和手段難以完全認識和真實反映微生物的群落組成。宏基因學技術分析克服了傳統微生物分析僅限于可分離培養組分的缺陷，通過對樣品中微生物基因序列的分析，可以快速確定微生物的種類和豐度，主要采用16S rDNA序列分析進行微生物的群落分析檢測出樣品中大量的低豐度生物。目前，宏基因組學技術已經應用于海洋、土壤、石油以及人體胃腸道等多個方面，但用于堆肥研究的較少。在牛糞堆肥中，通常以農作物秸稈、木質、鋸末廢棄物等作為輔料，起到加速堆肥過程和保證堆肥效果的作用。本研究就地取材，在牛糞中添加不同比例的鋸末，采用宏基因組學技術對不同比例鋸末添加產生的微生物進行對比分析，旨在明確堆肥微生物的群落組成，合理評價堆肥效果，為堆肥工藝研究應用提供一定的分子生態學依據。

1 材料與方法

1.1 堆肥試驗及樣品采集

試驗所用的牛糞和鋸末分別從湖南省武漢市南湖養殖場和永宏木材加工廠收集（鋸末作為調節劑）。堆肥試驗在實驗室內進行，以鋸末為調理劑，與牛糞充分混合后進行堆肥試驗，設置柱體高度為0.8 m，直徑為0.5 m，實行人工翻堆通氣，每3 d進行1次手工翻堆。在3個相同的堆肥容器內，將牛糞與鋸末分別按照2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1比例混合，堆肥45 d時取樣，分別在每個柱體的上、中、下采集樣品，然后將3個取樣點的樣品混合為1個樣品，3個堆肥容器所取的樣品分別編號為1、2、3號樣品。

1.2 數據分析方法

1.2.1 測序獲得序列的質量控制在試驗過程中，測序產物可能含有非特異性擴增片段，利用特異性引物信息可以將其去除；序列中可能含有模糊堿基、單堿基高重復區以及PCR過程中產生的一些嵌合體，將這些序列納入分析范圍會降低分析質量，因此去除此部分序列，可得到供精準分析的優化序列。

1.2.2 可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）分析首先提取非重復序列，堿基完全一致序列為重復序列只保留1條；然后與SILVA v119數據庫（http：//www.arb-silva.de/）中的aligned（16S/18S，SSU）核糖體序列比對，使用uchime軟件檢測PCR擴增中產生的嵌合體序列（Chimeric序列）并去除嵌合體序列；最后使用mothur V.1.33.3軟件進行距離計算與OTU聚類分析。OTU是在系統發生學或群體遺傳學研究中為了便于分析，人為給某一個分類單元（品系、屬、種、分組等）設置的同一標志。要了解一個樣品測序結果中的菌種、菌屬等數目信息，就須要對序列進行聚類操作（cluster）。通過聚類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，1個小組就是1個OTU。可根據不同的相似度水平，對所有序列進行OTU劃分，通常在97%的相似水平下對OTU進行生物信息統計分析。在進行OTU分類學分析時，首先將每一條優質序列都與數據庫進行比對，找出其最相近且可信度達80%以上的種屬信息；之后將每一個OTU中的所有序列進行類比，找出同一OTU中不同序列的最近祖先的種屬信息。將OTU綜合分類表中的信息按照門、綱、目、科、屬、種6個水平分別提取信息，分別統計各樣品在不同分類水平上的相對豐度。

2 討論

腸道疾病最有效的檢查方法是結腸鏡檢查，診斷和干預治療效果好，但是腸鏡直接插入體內，會給患者帶來許多不適和疼痛，會給予患者生理上和心理上的傷害，隨著醫療水平的提高，腸鏡的使用，有效改善了腸道疾病的診斷和治療，但是其并發癥等方面還有著局限性。

在結腸鏡檢查前的腸道準備中實施綜合性護理干預，臨床價值非常明顯，本研究中觀察組腸道清潔度高，腸鏡檢查所需時間少，一次插鏡成功率高（98.59%、80.28%），并發癥發生率低（9.86%、35.21%），差異均有統計學意義（P<0.05）。表明在結腸鏡診療前腸道準備中，護理方法不同，腸道清潔度不同，應綜合考慮患者的病情，實施個體化護理，促進患者腸蠕動，以期提高結腸鏡檢查效果。

綜上所述，綜合護理干預在結腸鏡診療前腸道準備中臨床效果良好，提高了腸道清潔度，縮短了檢查時間，降低了并發癥的發生，促進患者早日康復出院，值得臨床推廣。

參考文獻：

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