腸道病毒71型中和表位肽SP55、SP70及VP2-28在人血清中的抗體滴度特征研究

劉 倩，彭 琪，謝明玉，蔣再學，陸小梅，賴 茅，陳秀英

(1.東莞市兒科研究所，廣東 東莞 523325；2.東莞市兒童醫院，廣東 東莞 523325；3.廣東藥科大學附屬第一醫院中心實驗室，廣東 廣州 510080)

本文通過利用腸道病毒71型(EV71)陽性患者抗血清進一步對動物模型的中和表位肽進行篩選，研究動物中確定的表位肽與人抗血清的反應特征，現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料：本研究選擇2014年11月～2015年6月東莞市兒童醫院手足口病入院患兒，經Taqman熒光探針PCR檢測為腸道病毒通用型陽性，且EV71陽性的急性感染患兒。

1.2多肽序列及偶聯：本研究選取小鼠和兔子動物模型篩選到的三個EV71中和表位肽SP55、SP70、VP2-28，并應用MEGA5.0軟件將多肽序列與中國流行EV71的C4亞型進行序列比對。

1.3研究方法

1.3.1體外微量中和實驗：取50 μl患兒血清按倍比稀釋至96孔板中，加入100 TCID50 EV71病毒50 μg，37℃孵育1 h，加入Vero細胞，2×104細胞/孔。5% CO2，37℃培養4 d。觀察病變情況，以未發生病變的最大稀釋度作為血清的抗病毒滴度。

1.3.2酶聯免疫反應：合成多肽使用碳酸緩沖液稀釋至5 μg/ml，50 μl/孔，4℃包被過夜。2%BSA 37℃封閉1 h。棄封閉液，血清標本20 μl用含1%BSA的抗體稀釋液按4倍稀釋7個梯度，每孔加入抗體100 μl，每孔3個平行，37℃孵育1 h。PBST洗滌6次，5 min/次。羊抗人IgG二抗以及羊抗人IgM二抗用抗體稀釋液按1∶1 000稀釋，并等體積混合，每孔加入二抗100 μl，37℃孵育1 h，PBST洗滌6次，5 min/次。

2 結果

2.1EV71急性感染患兒血清采集：本研究從2014年11月～2015年6月，在EV71急性感染患兒的血清樣本中，經過體外微量中和實驗，篩選到13個中和抗體滴度較高的血清樣本。其中中和抗體滴度為2 048倍的8個，4 096倍的4個，8 192倍的1個。

2.2EV71中和表位多肽序列比對、合成及偶聯：分別在3個表位肽的N端和C端進行BSA偶聯，N端記為B-SP70、B-SP55和B-VP2-28，C端記為SP70-B、SP55-B以及VP2-28-B。見表1。

多肽名稱參考序列合成序列SP55PESRESLAWQTATNPPDSRESLAWQTATNPSP70YPTFGEHKQEKDLEYYPTFGEHKQEKDLEYVP2-28AGGTGTEDSHPPYKQAGGTGTEDTHPPYKQ

2.3ELISA分析抗血清中EV71抗體滴度：通過ELISA對人抗血清中EV71的抗體滴度進行分析，發現隨著抗血清的中和滴度從2 048倍升高到8 194倍，EV71的抗體滴度也隨之增高。見圖1。

圖1 EV71抗血清中和抗體滴度與病毒抗體滴度趨勢分析

2.4ELISA分析EV71動物模型中和表位肽在人抗血清中的抗體滴度：將偶聯有BSA的中和表位肽SP55、SP70和VP2-28通過ELISA的方法分析人抗血清中各多肽的抗體滴度。見圖2。

A：中和表位肽SP55在人抗血清中的滴度；B：中和表位肽SP70在人抗血清中的滴度；C：中和表位肽VP2-28在人抗血清中的滴度；D：中和表位肽SP55-B、B-SP70以及B-VP2-28在人抗血清中的滴度比較圖2 N端和C端偶聯對多肽抗體滴度的影響

3 討論

EV71病毒屬于微小病毒科，無包膜的RNA病毒。病毒有4個衣殼蛋白VP1～4，其中VP1～3構成衣殼的表面，而VP4與基因組RNA結合。12個VP1～3的五聚體構成二十面體的立體對稱結構[1-2]。EV71型病毒所致的手足口病(Hand foot and mouth disease，HFMD)極易發生嚴重并發癥造成嚴重的不良結局[3]。不斷研究和探索EV71型病毒基因型及抗體對疾病的發病機制、疫苗研制以及臨床治療均具有重要的臨床意義和價值[4]。

表位肽SP55和SP70是EV71中較為重要的線性中和表位，但是由于其作用機制尚未明確，并且SP55和SP70在EV71病毒感染后能否誘導機體產生抗體反應仍存在一定的爭議[5]。Foo等人在基礎實驗中表示，二者可誘導機體的抗體反應[6]，而在潘青松的研究中表示，二者不能誘導相應的中和抗體反應[7]。此外研究證實，VP2-28是VP上與E1反應強烈的肽鏈之一[8]，VP2-28對應的單抗是MAB979，而MAB979對多種不同的基因型EV71病毒均具有交叉中和效應，提示BP2-28是一個具有一定臨床研究價值的交叉中和表位肽，但VP2-28在誘導中和抗體中的作用及機制仍需進一步研究[9-10]。

本文綜合分析三個多肽在EV71陽性患者抗血清中的抗體滴度以及抗血清的中和滴度，發現EV71的中和抗體水平會隨著EV71總抗體水平的升高而升高。SP55肽無論在N端還是C端偶聯牛血清白蛋白BSA都具體較高的抗體滴度，但SP55肽C端偶聯BSA的抗體滴度隨著抗血清的中和滴度的升高而升高。SP70肽在人抗血清中的抗體滴度普遍不高，其中N端偶聯的SP70肽好于C端偶聯，VP2-28肽N端偶聯BSA的抗體滴度普遍高于C端偶聯。三個多肽中VP2-28和SP55在抗血清中具有更高的抗體滴度：VP2-28肽在抗血清中的抗體滴度最高，由以N末端偶聯BSA的VP2-28肽的抗體滴度為高。

本文通過EV71陽性患者的抗血清來初步對動物模型中試驗成功的中和表位肽進行篩選，去掉抗體滴度低的多肽，從而提高多肽疫苗在人體試驗的成功率，降低成本。