二甲雙胍對2型糖尿病合并結腸癌患者腫瘤組織中β-catenin及CD133表達的影響

張艷飛，龔錦強，黃柱連

二甲雙胍作為最常用的降糖藥物，多項研究顯示其能夠改善2型糖尿病合并結直腸癌患者的預后，術后口服二甲雙胍與其他降糖方案相比，死亡率顯著降低。Wnt/β-cateninn 通路的活性在結直腸癌干細胞內顯著增加，CD133也是結直腸癌干細胞的標志物之一[1-2]，β-cateninn及 CD133蛋白的高表達與結直腸癌的復發、轉移及化療藥物耐藥相關，提示腫瘤預后不良[3]。本研究通過免疫組織化學技術檢測結腸癌組織中β-cateninn及CD133蛋白的表達，探討二甲雙胍改善2型糖尿病合并結直腸癌患者預后的分子機制，現報道如下。

1 對象與方法

1.1研究對象2010 年 1 月至 2015 年 6 月我院普通外科手術治療且術前未進行放化療的2型糖尿病合并結腸癌患者的石蠟標本共計35例，常規HE染色明確診斷。二甲雙胍組19例(高分化3 例、中分化15例、低分化1 例)，非二甲雙胍組18例(高分化4 例、中分化11例、低分化3例)。同時收集兩組患者的臨床資料：年齡(歲)、糖尿病病程、體質量指數(body mass index, BMI)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、肌酐(creatinine, CR)、白蛋白(albumin, ALB)、甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholestrol, HDL-C)。

1.2主要試劑鼠抗人β-catenin 單克隆抗體 (cell signaling technology)，鼠抗人CD133 單克隆抗體 (博奧森生物技術有限公司)，通用型免疫組化超敏SP 試劑盒、DAB顯色試劑盒、PBS緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液 (均購自中衫金橋生物技術有限公司)。

1.3免疫組織化學SP法石蠟標本，4 μm厚切片，采用SP法，按試劑盒說明書步驟進行抗β-cateninn蛋白及抗CD133(1∶200)抗體免疫組織化學染色。陽性對照為已知陽性片，用PBS緩沖液代替一抗作為檢測的陰性對照。

1.4結果判斷β-cateninn蛋白染色結果的判定：鏡下見棕黃色細小顆粒為免疫組化陽性表達的信號，分析β-catenin 蛋白細胞膜、細胞質及細胞核的分布特征：小于70%的癌細胞胞膜陽性表達，或者大于10%的癌細胞細胞質或細胞核陽性表達均為陽性，即異常表達。CD133蛋白的染色結果的判定：在高倍光學顯微鏡(×400)下計數200 個癌細胞，計算包膜上有棕黃色物質細胞(陽性細胞)的構成比，≥10%為CD133蛋白表達陽性細胞。

2 結果

組間臨床資料提示二甲雙胍組患者體質量指數略低于非二甲雙胍組，其他指標，兩組差異無統計學意義，見表1。二甲雙胍組腫瘤組織中β-cateninn蛋白表達的陽性率為 36.84%，非二甲雙胍組為72.22%，差異有統計學意義(P<0.05)。二甲雙胍組蛋白表達于腫瘤細胞膜上，胞核內未見表達；非二甲雙胍組蛋白廣泛表達于腫瘤細胞的胞質及胞核內，見圖1，表2。二甲雙胍組CD133 蛋白表達的陽性率為21.05%，非二甲雙胍組為 50.00%。二甲雙胍組癌細胞巢內 CD133+ 細胞比例<10%；非二甲雙胍組癌細胞巢內 CD133+ 細胞比例>10%，見圖2，表2。二甲雙胍組CD133蛋白表達的陽性率低于非二甲雙胍組，但是差異無統計學意義 (P=0.07)。由于術前未進行放化療的手術標本量少，無法進行相關分析。

表1 兩組臨床指標比較

A：二甲雙胍組；B：非二甲雙胍組。圖1 β-catenin蛋白在結直腸癌組織中的表達(SP法)

表2 兩組β-cateninn 及CD133蛋白陽性率例(%)

A：二甲雙胍組；B：非二甲雙胍組。圖2 CD133蛋白在結直腸癌組織中的表達(SP法)

3 討論

結直腸癌的5 a生存率仍然是徘徊在50%左右，結腸癌耐藥引起的復發和轉移是進一步提高療效的主要障礙。對常規化療藥物耐藥的細胞多屬于腫瘤干細胞群[4]。晚期結腸癌細胞內，Wnt/β-cateninn通路活化，胞質內β-cateninn表達增加，其在胞質內累積后，進入細胞核，與核內轉錄因子共同作用，激活靶基因的轉錄[5]。在裸鼠體內運用腎被膜移植實驗鑒定的人類直腸癌的起始細胞(colon cancer initiating cell,CC-IC)，所有的CC-IC均為CD133+。免疫組化檢測顯示，正常的結腸癌組織中幾乎不表達CD133蛋白，而在復發和轉移的結直腸癌組織中CD133蛋白顯著高表達[7]。CD133是結直腸癌有效的預后因素，高表達說明其預后不良 。

既往的研究提示二雙胍可以特異性殺傷耐藥的腫瘤干細胞，同時抑制腫瘤干細胞的產生，作為非毒性的抗腫瘤藥，可以與常規化療藥物發揮協同作用。二甲雙胍可以通過降低主要驅動因子的表達，進而抑制上皮間質轉化，減少了乳腺癌干細胞的發生[8]。二甲雙胍聯合索拉非尼可殺傷對替莫唑胺耐藥的膠質母細胞瘤干細胞樣細胞[9]。阿霉素抑制裸鼠體內移植的腫瘤組織(乳腺癌、前列腺癌、肺癌)的生長和復發，而二甲雙胍加原劑量的1/4的阿霉素對腫瘤組織的抑制效果與之前相同[10]。二甲雙胍作用于成骨細胞后，可以促進β-cateninn蛋白的磷酸化降解，進而降低胞質內β-cateninn蛋白水平，抑制了Wnt/β-cateninn通路活性[11]。體外細胞培養研究證明二甲雙胍可通過下調Wnt /β-cateninn信號通路進而減少結腸癌細胞對常規化療藥物的耐藥性。

本研究對二甲雙胍組及非二甲雙胍組的臨床資料進行比對，由于二甲雙胍有減輕體質量的作用，兩組間BMI有顯著性差異，其他指標均無顯著差異。二甲雙胍組患者腫瘤組織中β-catenin及CD133蛋白的表達低于非二甲雙胍組。因此，二甲雙胍可能對結直腸癌組織中干細胞具有一定的抑制作用。肥胖是結直腸癌的危險因素，動物實驗中發現在飲食誘導肥胖的小鼠結腸黏膜組織中腫瘤壞死因子-α升高，并引發Wnt信號通路內關鍵組分包括β-cateninn蛋白及其下游的靶基因c-myc的表達增加，進而促進了結直腸癌的發生發展[12]。因此，二甲雙胍對體質量的影響，也可能是其改善合并2型糖尿病的結直腸癌患者預后的機制之一。由于標本數量有限，本研究具有一定的局限性，有待進一步擴大樣本量深入探討。