海帶配子體采集過程中的污染防控

武瑞娜，羅世菊，賽 珊，趙聚萍，李曉捷，田萍萍，王偉偉

（1.山東東方海洋科技股份有限公司，山東 煙臺 264003；2.國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東 煙臺 264003；3.山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點實驗室，山東 煙臺 264003）

海帶是一種自然分布于北太平洋和北大西洋的冷水性大型經(jīng)濟食用海藻，自1927年從日本海域引入我國海域[1-2]之后，漸漸適應(yīng)了我國的海洋環(huán)境條件，并發(fā)展成為重要的人工栽培經(jīng)濟海藻[3-6]。目前，我國的遼寧省、山東省、江蘇省、浙江省、福建省和廣東北部等沿海地區(qū)，為主要的海帶養(yǎng)殖區(qū)域。

海帶配子體是海帶種質(zhì)資源的最佳保存形式，也是海帶進行雜交育種育苗及進一步研究分析的材料。海帶配子體在生長過程中常會受到病原生物的危害，甚至導(dǎo)致配子體發(fā)病死亡[7]，細菌、真菌及雜藻污染是海帶配子體克隆保存過程中需要解決的問題[8]。為了阻絕海帶配子體采集過程中的污染源，該研究比較了紫外線照射和臭氧消毒對環(huán)境的消毒效果。

1 材料與方法

1.1 海帶配子體采集前環(huán)境消毒

1.1.1 消毒方法 采用紫外燈消毒和臭氧消毒，選擇功率適宜的紫外線燈管（30 W，3支），燈管距離地面約2 m，燈亮7～8 min開始計時，消毒時間分別設(shè)0.5 h和1.0 h。根據(jù)壁掛式臭氧發(fā)生器（煙臺豪爾電器，HR-CF，3 g/h，80 W）操作規(guī)程使用，消毒時間分別設(shè)0.5 h和1.0 h，實驗室20 m2。用平板自然沉降法于消毒前及消毒后不同時段采樣培養(yǎng)統(tǒng)計菌落數(shù)。

1.1.2 空氣菌落采樣方法 將直徑90 mm的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿，分別置于實驗室的四角距墻壁1 m的位置和中央，距地面的高度為1 m，同時打開培養(yǎng)皿蓋暴露30 min后，收集樣本和空白培養(yǎng)平板置于35℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，然后取出培養(yǎng)皿進行計數(shù)，2種消毒方法各進行10次重復(fù)試驗及空氣培養(yǎng)，分別統(tǒng)計培養(yǎng)平板上菌落數(shù)，最后得出實驗室消毒前后空氣中的菌落平均數(shù)，另外，同一試驗空間利用不同消毒方式消毒試驗時間差設(shè)為14 d，避免前后影響產(chǎn)生假象。

1.2 海帶種菜消毒

剪取帶有成熟孢子囊的種帶塊，每塊大小約4 cm×4 cm。先用滅菌的脫脂棉蘸取煮沸冷卻到10～15℃的海水進行擦洗，去除種帶塊表面的雜藻及其他附著物。擦洗好的種帶塊放在滅菌培養(yǎng)皿里進行實驗。對照組采用傳統(tǒng)采集方法（即擦洗好的種帶塊放到盛煮沸冷卻海水的燒杯里直接放散）獲得游孢子，游孢子附著成為胚孢子，胚孢子萌發(fā)后長成配子體。試驗組進一步采用抽濾的1.5%KI（國藥）和雙抗（青霉素80 mg/L+鏈霉素0.1%）這兩種消毒劑及二者聯(lián)合使用在不同消毒時間組合處理后進行放散獲得游孢子，游孢子附著成為胚孢子，胚孢子萌發(fā)后長成配子體。每塊種帶塊采1個染色缸（含有4個載玻片），每組設(shè)6個平行。培養(yǎng)條件為：10℃，持續(xù)光照1 000 lx，營養(yǎng)鹽NaNO3-N 10 g/m3、KH2PO4-P 1 g/m3，20 d 后鏡檢觀察各組游孢子放散情況，統(tǒng)計游孢子附著率、胚孢子萌發(fā)率及采集染色缸的污染率。

消毒劑及處理時間分別為：1.5%KI分別處理10、15、20 min；雙抗（青霉素 80 mg/L+鏈霉素0.1%）分別處理 10、15、20 min；1.5%KI處理 10min+雙抗處理 10 min；1.5%KI處理 15 min+雙抗處理 15 min；1.5%KI處理20 min+雙抗處理20 min；然后各組再用煮沸冷卻抽濾海水浸泡5 min，分別進行放散附著。

1.3 海帶配子體分離

選用最佳處理方式處理過的種帶放在抽濾的消毒海水里放散，獲得游孢子后移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 d左右進行單配子體分離。

在徹底消毒的超凈工作臺內(nèi)，用微毛細吸管在顯微鏡下分別挑選單個的、色素、狀態(tài)較好的♀、♂配子體到5 mm×5 mm的小蓋玻片上，及時進行鏡檢觀察挑取的克隆狀態(tài)，檢查是否是單個并分好♀、♂，然后用滅菌的鑷子將鏡檢合格的玻片轉(zhuǎn)移到盛有抽濾海水培養(yǎng)液的試管里，用滅菌的脫脂棉封口，貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽上要注明♀、♂配子體的編號及分離日期，20支試管為一扎，用橡皮筋困好后，再用一張15 cm×15 cm的錫箔紙做一個錫紙蓋蓋在上面，放入溫度8～12℃、持續(xù)光照1 000～1 500 lx的光照培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，營養(yǎng)鹽NaNO3-N 10 g/m3、KH2PO4-P 1 g/m3，約45 d更換1次培養(yǎng)液。

2 試驗結(jié)果

2.1 海帶配子體采集分離前環(huán)境消毒方法效果的比較

利用這2種方法消毒的實驗室其室內(nèi)菌落數(shù)顯著減少。臭氧消毒1 h殺菌率可達99.2%，利用紫外線消毒1 h殺菌率僅達87.4%，臭氧消毒明顯比紫外線消毒效果好（表1）。

表1 2種消毒方法及不同消毒時間對室內(nèi)菌落數(shù)的影響

2.2 海帶種帶消毒方法比較

對照組的種帶塊未使用消毒劑進一步處理，其游孢子的附著率和胚孢子的萌發(fā)率都是最高的，但采集染色缸的污染率也是最高的，試驗組隨著處理時間的延長，游孢子的活性明顯減弱，附著率下降，且在長時間處理過程中種帶孢子囊會過度放散，致使采集密度過低，即使無污染，也不適合作為種帶處理的方法，所以1.5%KI+雙抗海水20 min+20 min的組合不可取。綜合考慮游孢子附著率、胚孢子萌發(fā)率和采集染色缸的污染率得出結(jié)論：1.5%KI15 min+雙抗海水15 min的組合最佳（表2）。

表2 不同消毒處理方法的比較

圖1 海帶配子體采集

2.3 海帶配子體防污染分離

選用1.5%KI 15 min+雙抗海水15 min的組合處理過的種帶塊置于抽濾的消毒海水里放散，可以采集到無污染的海帶游孢子（圖1-A）。游孢子附著成為胚孢子后萌發(fā)，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 d左右胚孢子發(fā)育成配子體（圖1-B）。這時可以利用微吸管分離法進行配子體分離，獲得無污染的單配子體克隆（圖1-C），通過試管保存在10℃、1 000 lx持續(xù)光照的培養(yǎng)箱中（圖1-D）培養(yǎng)。在配子體分離過程中，要對實驗室環(huán)境、超凈工作臺、顯微鏡、試管、微吸管、脫脂棉、錫箔紙等進行嚴格消毒，并嚴格遵守?zé)o菌操作，才能有效達到污染防控目的。

3 討論

紫外線空氣消毒法，作為一種較傳統(tǒng)的空氣消毒方法[9]，作用原理主要通過對病菌微生物的輻射損傷和對核酸的破壞功能使微生物致死，以達到消毒的目的。利用臭氧機進行室內(nèi)空氣消毒，是近幾年新興的一種消毒方法，臭氧可以殺滅細菌真菌及其細菌繁殖體、芽孢等，殺菌譜較廣。該研究結(jié)果顯示，采用臭氧機消毒法明顯比紫外線消毒法效果好，臭氧消毒1 h室內(nèi)基本可達到無菌的效果，所以臭氧消毒法應(yīng)是實驗室環(huán)境消毒的常用方法，在無人的狀態(tài)下開啟臭氧機1 h，即可達到消毒目的。

對種帶的消毒處理首先要考慮種帶的正常放散及游孢子的活性，該文選取了兩種消毒劑及其聯(lián)合使用在不同的時間組合下對種帶塊進行消毒處理實驗，結(jié)果顯示常規(guī)擦洗種帶塊后，用抽濾的1.5%KI海水溶液浸泡15 min，然后用雙抗（青霉素80 mg/L+鏈霉素0.1%）溶液浸泡15 min為最佳的處理方法。最后用抽濾的相對無菌海水浸泡5 min，再轉(zhuǎn)到裝有75～100 mL抽濾海水的250 mL藍蓋瓶里等待放散。此方案污染防控效果最佳，且胚孢子的萌發(fā)率也相對較高。

選用最佳處理方式處理好種帶后放散獲得無污染的游孢子，附著后繼續(xù)培養(yǎng)20 d左右利用微吸管進行單配子體分離，獲得無雌雄混雜、無污染、單個的配子體，從源頭上控制了污染菌的機會，大大提高了配子體克隆的成活率，基本可以達到相對無菌的目的，從而可以延長換水周期，節(jié)約人力物力。