結直腸癌組織中表皮生長因子受體表達與κ-ras基因突變及蛋白表達的關系

賈曉艷，李 俊，劉 萍，楊宏山

西妥昔單克隆抗體是結直腸癌分子靶向治療最常用的藥物，通過阻斷EGFR-Ras-Raf-MAPK途徑達到抗腫瘤作用。在西妥昔單抗治療中，κ-ras基因突變可導致生長信號持續下傳而耐藥，κ-ras基因突變狀態也成為結直腸癌精準治療的重要組成部分［1］。該研究檢測了結直腸癌組織中表皮生長因子受體 （epithelial growth factor receptor，EGFR）表達與κ-ras基因突變及κ-ras蛋白表達的關系，探討其與結直腸癌病例特征的關系，為臨床篩選西妥昔單抗受益人群提供幫助。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機選取孝感市中心醫院2016年—2017年間手術切除的結直腸組織標本95例，其中結腸癌19例，直腸癌76例。樣本對應的患者中，男57例，女38例；年齡45～89 歲，其中年齡＜60歲34例，≥60歲61例；發現淋巴結轉移者46例，未發現淋巴結轉移者49例；TNM分期 （2016結直腸癌AJCC/UICC TNM分期第八版標準）Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期80例。

1.2 方 法

1.2.1 免疫組化染色 全部病例均經中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，3μm連續切片，常規脫蠟水化。采用檸檬酸鹽高溫高壓修復，3%過氧化氫溶液浸泡以消除內源性過氧化氫酶活性，PBS緩沖液震蕩沖洗。一抗室溫（25℃）孵育1 h，二抗室溫孵育80 min 30 s。DBA顯色，蘇木精復染，1%鹽酸乙醇分化，流水返藍，風干后中性樹膠封片。以已知陽性切片作為對照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 組織DNA抽提與測定 采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒進行石蠟包埋組織樣本DNA的提取。提取出的樣品在多功能酶標儀上進行DNA濃度和純度的測定。

1.2.3 PCR擴增及基因突變檢測 PCR反應擴增κ-ras第2外顯子，目的片段長度167 bp。上游引物5'-AGGCCTGCTGAAAATGACT-3'（forward）；下 游引物 5'-AATGGTCCTGCACCAGTAA-3'（reverse）。反應步驟與條件見表1。將PCR產物置于Light Scanner中，收集熒光信號，進行基因突變檢測。

表1 PCR反應步驟與條件

1.3 結果判斷

1.3.1 免疫組織化學 EGFR蛋白陽性表達表現為細胞膜及部分近細胞膜的胞質可見黃色顆粒，κ-ras蛋白陽性表達表現為細胞質可見黃色顆粒。高倍鏡下選擇4個視野，按照腫瘤細胞染色強弱計分，未見染色計分0分，淡黃色計分1分，棕黃色計分2分，深棕色、棕褐色、粗顆粒計分3分。按照陽性細胞占所有結直腸癌細胞的比例計分，陽性細胞比例低于25%計分1分，陽性細胞比例25%～50%計分2分，陽性細胞比例50%～75%計分3分，陽性細胞比例高于75%計分4分。染色程度計分與陽性細胞比例計分的乘積為總得分，總得分≥3分為蛋白表達陽性，＜3分為陰性。由兩位以上資深病理科醫師雙盲閱片，得出結果。

1.3.2 高分辨率熔解曲線 將收集到的熒光信號，分別與陽性標準品、陰性對照、空白對照對比，確定樣本突變狀態。

1.3.3 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行數據統計分析處理，統計方法采用卡方檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFR蛋白在結直腸癌組織中的表達情況如圖1所示，EGFR蛋白陽性表達定位于細胞膜，陽性率為81.1%（77/95），在結腸癌與直腸癌中表達率分別為78.9%、81.6%。EGFR蛋白表達與患者其他臨床病理指標如性別、年齡，腫瘤發生部位、浸潤深度、腫瘤長徑、大體分型、遠隔轉移及TNM分期等無顯著相關關系（P＞0.05），具體數據見表2。

圖1 EGFR蛋白陽性表達（SP×200）

2.2 κ-ras基因在結直腸癌組織中的突變情況結直腸癌組織中κ-ras基因的突變頻率為36.8%（35/95），其中結腸癌突變率為 42.1%（8/19），直腸癌突變率為35.5%（27/76）。突變型熔解曲線如圖3、圖4所示。基因突變與患者臨床病理指標如性別、年齡，腫瘤發生部位、浸潤深度、腫瘤長徑、大體分型、轉移及TNM分期之間無顯著相關關系 （P＞0.05），具體數據見表 2。

表2 結直腸癌組織中EGFR蛋白表達、κ-ras基因突變及κ-ras蛋白表達情況

圖2 EGFR蛋白陰性表達（SP×200）

圖3 κ-ras基因第2外顯子突變曲線

圖4 κ-ras蛋白陽性表達（SP×200）

2.3 κ-ras蛋白在結直腸癌組織中的表達情況如圖5所示，κ-ras蛋白陽性表達定位于細胞質，陽性率60.0%（57/95）。κ-ras蛋白表達與結直腸癌組織的分化程度相關，高中分化組、低分化組的陽性率分別為 66.7%（38/74），50.0%（19/21），P=0.003，二者差異有統計學意義；κ-ras蛋白表達與患者其他臨床病理指標如性別、年齡，腫瘤發生部位、浸潤深度、腫瘤長徑、大體類型、淋巴結轉移及TNM分期等無顯著相關關系（P＞0.05），具體數據見表2。

2.4 EGFR蛋白表達與κ-ras基因突變，EGFR蛋白表達與κ-ras蛋白表達，κ-ras基因突變κ-ras蛋白表達的相關性 EGFR陽性表達組κ-ras基因突變率為35.1%，EGFR陰性表達組κ-ras基因突變率44.4%，差異無統計學意義（表3）。EGFR陽性表達組κ-ras蛋白表達率與陰性表達組為59.7%和61.1%，差異無統計學意義（表4）。κ-ras突變型組κ-ras蛋白表達率為65.7%，野生型組表達率為56.7%，無統計學差異（表5）。

表3 EGFR蛋白表達與κ-ras基因突變的關系

表4 EGFR蛋白表達與κ-ras蛋白表達的關系

表5 κ-ras基因突變與κ-ras蛋白表達的關系

3 討論

結直腸癌分子靶向治療中，最常用的藥物為西妥昔單抗［2］。西妥昔單抗是抗EGFR單克隆抗體，可與EGFR特異性結合，通過與EGF、TGF-α競爭受體，抑制生長信號下傳，進而抑制細胞增殖，多用于轉移性結直腸癌二、三線治療［3］。然而，在應用過程中，發現部分患者應用西妥昔單抗療效不明顯，可能與耐藥有關。針對西妥昔單抗耐藥，可能的機制包括：EGFR在結直腸癌中低表達或不表達，EGFR信號通路中下游某些基因自發激活，如κ-ras、nras、b-raf、PI3K突變導致的自發激活及其編碼蛋白的自發激活等［4，5］，導致腫瘤的持續生長［6］。EGFR 作為西妥昔單抗的作用靶點，在包括結直腸癌在內的多種惡性腫瘤的發生發展中起重要作用［7］。但目前尚未發現EGFR表達對結直腸癌的預后及西妥昔單抗的療效有確定性影響［8］。

κ-ras突變狀態是判斷患者對西妥昔單抗治療是否耐藥的重要依據，故在使用前需對患者腫瘤組織進行檢測，以確定是否有從該藥物中獲益的可能。另一方面，西妥昔單抗價格高昂，盲目使用不僅給患者帶來沉重的經濟負擔，還可能延誤治療，失去最佳治療時機。因此，美國國立綜合癌癥網絡（NCCN指南）明確指出，在應用含西妥昔單抗的方案治療轉移性結直腸癌的患者前，均應先檢測腫瘤κ-ras基因的突變狀態，如該基因為突變型，則西妥昔單抗耐藥的可能性大，不推薦使用。然而，并非κras基因為野生型的患者均能從西妥昔單抗中獲益，ras基因家族中的n-ras基因突變也可導致患者對西妥昔單抗治療失敗［9］，這部分患者常混雜在κras基因野生型的患者中。除此之外，EGFR信號通路下游的b-raf基因突變也可導致西妥昔單抗耐藥。b-raf基因突變還提示腫瘤預后不良，但b-raf抑制劑未能顯示抗腫瘤活性［10］。故在條件許可的情況下，應對患者可能影響西妥昔單抗療效的分子標志物均進行檢測，最大限度地保證西妥昔單抗治療的療效。

目前實驗室κ-ras基因突變檢測方法有多種，例如測序法、聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性測序法（PCR-RFLP）、聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性分析 （PCR-SSCP）、探針擴增阻滯突變系統（ARMS）、實時熒光定量PCR、高分辨率熔解曲線法等，各種檢測方法均有其優缺點。該研究使用的HRM是近年來興起的一種新的基因突變掃描方法，該方法具有快速、簡便、高通量的優點，而且全程閉管操作，不會因交叉污染而導致結果出現偏差。目前也已經有研究證實HRM技術檢測基因突變與其他基因突變檢測技術相比，具有準確、敏感、操作簡便，且價格較低的優勢，在實際應用中具有巨大的潛力［11，12］。HRM技術不僅可以檢測已知突變，還可以掃描未知突變，但若需明確突變類型，仍需采用其他檢測方法進一步檢測突變類型。

該研究中，EGFR陽性表達率為81.1%，提示大部分結直腸癌患者存在EGFR單抗類藥物靶點。其中EGRR陽性表達組κ-ras蛋白表達率與陰性表達組分別為59.7%、61.1%，差異無統計學意義。提示EGFR蛋白表達對κ-ras蛋白表達無明顯影響。κras突變型組κ-ras蛋白表達率為65.7%，野生型組表達率為56.7%，未發現統計學相關性，提示不能通過κ-ras蛋白表達情來預測κ-ras基因突變狀態。κ-ras突變對信號鏈的影響可能并不是通過蛋白表達率來實現的，突變可能影響κ-ras蛋白功能，通過使低度活性的蛋白處于持續活化狀態促進生長信號的傳遞。EGFR蛋白、κ-ras基因與κ-ras蛋白均從一定程度上促進了腫瘤的演進，但三者之間如何相互作用仍不甚清楚，需要大樣本的檢測與更多實驗進一步探討。未來將會發現更多的方法與技術，更好地篩選分子靶向藥物而使人群受益。