蛋白層析系統(tǒng)的使用與維護

李曉英 趙艷景 閻斌倫 董志國

（淮海工學院 江蘇省海洋生物技術重點實驗室，連云港 222005）

蛋白質(zhì)是生命體的基本組成物質(zhì)，也是生命活動最終控制者和直接執(zhí)行者，它幾乎參與了所有生命活動，人類對于蛋白質(zhì)的研究已經(jīng)有一百多年的歷史。蛋白層析系統(tǒng)是當前蛋白純化工作中常見的一種設備，自動化程度較高，本文結(jié)合筆者多年使用該儀器的工作經(jīng)驗，以美國伯樂公司的Biologic Duoflow蛋白層析系統(tǒng)為例，對蛋白層析系統(tǒng)結(jié)構、工作原理、常用的蛋白分離方法及使用與維護手段進行詳細介紹，旨在提升初學者使用該系統(tǒng)的能力，加強我國蛋白質(zhì)分離技術。

1 Biologic Duoflow蛋白層析系統(tǒng)構造及工作原理

蛋白純化系統(tǒng)由4部分構成，即梯度泵、混合器、檢測器和組分收集器。Biologic Duoflow蛋白純化系統(tǒng)的工作原理如圖1所示。

圖1 蛋白純化系統(tǒng)工作原理

在蛋白純化系統(tǒng)中，梯度泵是整個系統(tǒng)的心臟，實驗所用的所有試劑、樣品都是通過梯度泵進入到整個管路中進行分離的。混合器通常在進行離子交換層析時使用，它能將兩種緩沖液按不同百分比進行配比。檢測器是蛋白純化系統(tǒng)的“眼睛”，它的檢測波長范圍為10～700nm，只要存在分離的蛋白質(zhì)便能檢測出來，然后在電腦記錄儀上以洗脫峰形式呈現(xiàn)出來，同時將相關信息傳導至組分收集器中。

2 幾種常見的蛋白分離方法

2.1 親和層析

親和層析是利用生物大分子與某些相對應的專一分子特異識別和可逆結(jié)合的特性而建立起來的一種分離生物大分子的層析方法。該蛋白分離方法選擇性強、純化效率高，常常可以一步獲得滿意的純化效果。但由于親和層析法依賴的是生物學特異性而不是物理化學性質(zhì)，故只適用于分離低濃度的待純化蛋白質(zhì)。

2.2 凝膠過濾層析

俗稱分子篩，是利用具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構的顆粒的分子篩作用，根據(jù)被分離樣品中各組分相對分子質(zhì)量大小的差異進行洗脫分離的一項技術。利用凝膠過濾層析進行蛋白分離，高分子量的蛋白質(zhì)在填料顆粒間隙中流動，比低分子量早流出柱子，中等大小的蛋白質(zhì)可以進入填料分子中較大的孔內(nèi)，而小蛋白質(zhì)可以進入所有填料的孔內(nèi)，有最大的通過體積。

2.3 離子交換層析

該方法主要是利用不同蛋白質(zhì)表面電荷性質(zhì)達到蛋白分離、純化蛋白質(zhì)的目的。分離柱的交換劑是由大量帶電荷的側(cè)鏈和不溶性樹脂結(jié)合而成。蛋白溶液進入離子交換柱后，與離子交換樹脂無親和力的蛋白質(zhì)被洗脫，余下的蛋白質(zhì)均結(jié)合在樹脂上，但與樹脂的親和力又各不相同，此時可逐漸提升洗脫液中NaCl濃度，將其逐一洗脫出來，這樣就達到了分離蛋白質(zhì)的目的。

2.4 疏水作用層析

該方法以介質(zhì)疏水基團和蛋白質(zhì)疏水區(qū)域間的親和作用為基礎，可溶性蛋白質(zhì)在外表面存在疏水小區(qū)，這些暴露的疏水區(qū)對疏水層析是非常理想的場所。溶液鹽濃度增加時疏水作用變得更強，所以大多數(shù)疏水層析都是高鹽時上樣，降低鹽濃度時洗脫。分離溫和且分離蛋白質(zhì)含量高，使疏水層析在蛋白質(zhì)純化中成為很有價值的一種技術方法。

3 Biologic Duoflow蛋白層析系統(tǒng)的保養(yǎng)與維護

為了確保系統(tǒng)的穩(wěn)定運行，每次的開機順序為：先開硬件系統(tǒng)，即按照梯度泵、檢測器、混合器以及組分收集器順次依次打開電源開關，待硬件系統(tǒng)穩(wěn)定后，再打開電腦監(jiān)視器的軟件系統(tǒng)。

所有用于層析系統(tǒng)的水、緩沖液等試劑溶液，要和所有樣品一樣，在使用前通過0.45μm微孔濾膜過濾，并通過真空抽氣裝置或超聲波對以上各試劑溶液和樣品脫氣，確保溶液和樣品中無微顆粒或溶解氣體。

實驗之前要用配套的注射器對梯度泵進行真空抽氣，操作的順序為：先將注射器插入梯度泵的“Priming”接口，再旋松螺旋，抽出泵中的溶液，抽完之后先旋緊螺旋再拔注射器。重復上述操作數(shù)遍，直到抽出溶液不含氣泡為止。

每次實驗之前都要將閥門轉(zhuǎn)到Purge位，沖洗梯度泵約2min左右，確保梯度泵內(nèi)沒有氣體為止。用過濾脫氣的超純水沖洗梯度泵及其管道，再用針筒各抽取10ml超純水打入泵上方的泵頭沖洗入口，進行泵頭清洗。若設備長時間停用，還要進行停用維護，操作順序為：先對梯度泵進行真空抽氣操作，然后用過濾脫氣的20%乙醇溶液沖洗整個系統(tǒng)、閥門及其管道，并定期檢查與維護。

4 應用實例

抑癌活性蛋白是當前研究的熱點，縊蟶抗癌活性蛋白組分Y3就是縊蟶經(jīng)緩沖液浸提后，利用Biologic Duoflow蛋白層析系統(tǒng)和DEAE纖維素離子交換層析，得到不同蛋白質(zhì)組分，收集具有抑癌活性較強的峰3，如圖2所示。

峰3經(jīng)Sepharose CL-6B凝膠層析純化，收集具有抑癌活性更強的峰3，簡稱Y3，如圖3所示。

圖2 DEAE離子交換圖譜

圖3 Sepharose CL-6B凝膠層析圖譜