女士保健酒功效成分含量阿魏酸測定研究

李 妍，梁慧珍，張長霞，蘇 靜，陳 鵬，賈士儒

(1.天津科技大學生物工程學院，天津300457； 2.天士力控股集團研究院健保食品開發中心，天津300410）

女士保健酒是由當歸、人參、黃精、玉竹、枸杞子、大棗6味藥材滲漉而成的18%vol保健酒，具有美白祛斑、調經止痛、補血活血、益氣安神之功效。其中當歸中的阿魏酸（ferulic acid，FA），化學名為：4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸，是廣泛存在于當歸、川芎、紅花等中藥材的有效成分之一[1]，常作為中藥成分及其制劑中定性定量的化學指標用于評價和控制制劑的質量[2]。藥理研究表明，阿魏酸具有抗氧化、抑制血栓的形成、增加冠脈流量、改善心肌缺血、抑制膠原和ADP誘導的血小板聚集作用。目前阿魏酸已成為臨床應用的活血祛淤藥物之一[3]。當歸中的阿魏酸在較低濃度下能顯著降低酪氨酸酶的單酚酶活力，也是一種強效的酪氨酸酶抑制劑[4]。5 mol/L的阿魏酸都可有效地抑制蝦血淋巴褐變，阿魏酸將蝦血淋巴中酪氨酸酶酶活抑制至5.97%[5]。在實際應用中，發現阿魏酸水溶液放置一段時間后,在阿魏酸色譜峰旁出現一小峰[6-7]。后出現的峰很可能是阿魏酸的轉化產物。而且隨著時間的延長,轉化產物的量越來越大,直至最后達到平衡。已有許多學者研究表明，阿魏酸的性質不穩定。賈曉斌等[8]研究表明，阿魏酸在溶液中不穩定，其樣品溶液和對照品溶液均出現了不同程度的降解；康宇紅等[9]考察了pH值及溫度對阿魏酸鈉注射液穩定性的影響，研究結果表明，其穩定性受pH值和溫度影響較大；李行利等[10]的研究結果表明，阿魏酸的降解反應屬于一級動力學反應，但是都沒有對這些現象進行深入探討和給出合理的解釋。

穩定性研究是保健酒研究與開發的一項重要內容，是保證保健酒有效性和安全性的重要基礎。功效性成分若發生分解、變質，不僅會影響其外觀，而且可引起有效成分的含量變化和效果的降低，導致保健酒失效，甚至產生或增加毒副作用，危及患者的健康和生命安全。

穩定性試驗的目的是考察女士保健酒在溫度、濕度、光線的影響下隨時間變化的規律，為保健酒的生產、包裝、貯存、運輸條件提供科學依據，同時通過試驗建立保健酒的有效期。

加速試驗是指在保證不改變產品失效機理的前提下,通過強化試驗條件,使受試產品加速失效,以便在較短時間內獲得必要信息,來評估產品在正常條件下的可靠性或壽命指標。通過加速試驗,可迅速查明產品的失效原因,快速評定產品的可靠性指標。

為保證女士保健酒的質量，本研究采用高效液相色譜法檢測保健酒中的阿魏酸，優化檢測方法。并用加速試驗考察3批女士保健酒中阿魏酸的穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑（表1）

表1 實驗所用試劑

枸杞子、玉竹和黃精，2017年購于國藥樂仁堂河北藥業有限公司；林下山參，2016年購于遼寧天士力森濤參茸股份有限公司；當歸，2017年購于甘肅漢草品匯中藥飲片有限公司；大棗，2017年購于滄州銘鑫食品有限公司；食用酒精，2017年購于吉林省新天龍實業股份有限公司。

經檢驗，枸杞子中的水分、總灰分、浸出物、枸杞多糖，玉竹中的水分、總灰分、浸出物、玉竹多糖，黃精中的水分、總灰分、浸出物、黃精多糖，林下山參中的水分、總灰分、人參Rg1、人參Re、人參Rb1，當歸中的水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、揮發油、阿魏酸，均符合《中國藥典》（2015年版第1部）的規定。

1.2 儀器與設備

色譜柱（Venusil MPC_18(2)），天津博納艾杰爾科技有限公司；KQ-250E型超聲波清洗器（KQ250），昆山市超聲儀器有限公司；安捷倫1260高效液相色譜儀（1260 InfinityII），美國安捷倫公司；Milli-Q超純水處理系統（Milli-QAdvantage），北京艾澤信科技有限公司密理博北京代理；XS105型十萬分之一天平（XS105 DualRange），梅特勒-托利多儀器上海有限公司；生化培養箱（SPX-250BIII），天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 阿魏酸檢測

1.3.1.1 供試品溶液制備

取女士保健酒成品酒（批號：20170103）過0.45μm濾膜后備用。

1.3.1.2 對照品溶液制備

取阿魏酸對照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加70%甲醇制成12μg/mL的溶液，即得。

1.3.1.3 色譜條件[11]

色譜柱：Venusil MPC18(2)（4.60×250 mm，5μm），流動相：乙腈-0.085%磷酸溶液（17∶83）；檢測波長為316 nm；柱溫35℃，流速0.80 mL/min，進樣量：10μL。

1.3.1.4 線形關系考察

分別精密吸取已配制好的濃度為0.036 mg/mL的對照品阿魏酸溶液0.10 mL、0.70 mL、1.40 mL、2.10 mL、2.80 mL、3.50 mL于5 mL容量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別進樣10μL，記錄色譜圖和峰面積。以峰面積Y為縱坐標，阿魏酸濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.1.5 精密度實驗

取同一批次女士保健酒，按照“1.3.1.1”制備供試品溶液1份，按照“1.3.1.3”方法，連續進樣6次，記錄阿魏酸峰面積。

1.3.1.6 穩定性實驗

精密取吸女士保健酒樣品按照“1.3.1.1”制備供試品溶液和“1.3.1.2”的阿魏酸對照品溶液，按照“1.3.1.3”方法，分別于配制后的0、1.5 h、3 h、4.5 h、6 h、7.5 h進行測定，記錄阿魏酸峰面積。

1.3.1.7 重復性實驗

取同一批次女士保健酒，按照“1.3.1.1”制備供試品溶液6份，按照“1.3.1.3”方法測定并計算。

1.3.1.8 專屬性實驗

阿魏酸專屬性樣品制備：女士保健酒的處方中不加入當歸藥材制成的滲漉液為陰性對照。將陰性對照、按照“1.3.1.1”制備的女士保健酒供試品溶液及阿魏酸標準溶液按照“1.3.1.3”方法色譜條件進行檢測。記錄液相色譜圖。

1.3.1.9 加樣回收率實驗

取“1.3.1.5”同一女士保健酒樣品按照“1.3.1.1”制備供試品溶液5 mL 9份，置于10 mL容量瓶中，以“1.3.1.5”測得的阿魏酸平均含量值作為加入對照品含量的依據，約供試品中阿魏酸含量55.13%、110.25%、175.01%的對照品各3份分別對應加供試品溶液，共9份，搖勻，按“1.3.1.3”方法測定，計算阿魏酸的含量和回收率。

1.3.2 阿魏酸的穩定性

根據《中國藥典》2015年版第2部附錄藥物制劑穩定性試驗指導原則的有關要求,對女士保健酒中阿魏酸的穩定性進行試驗研究。取一定數量按1.3.1.5方法測定同一女士保健酒樣品,置于37℃的恒溫培養箱(溫差±1℃)內3個月。每7天定時取樣,每次2支,混勻,依法測定含量。

2 結果與分析

2.1 阿魏酸檢測

2.1.1 線性關系考察

按照“1.3.1.4”方法操作，以峰面積Y為縱坐標，阿魏酸濃度為橫坐標，得線性回歸方程為Y=63989X-0.7676，R2=0.9999，結果表明，阿魏酸進樣量在0.0072～0.25μg范圍內具有良好的線性關系（見圖1）。

圖1 阿魏酸標準曲線

2.1.2 精密度

按照“1.3.1.5”操作，計算結果的6次進樣峰面積RSD為1.02%，見表2。表明儀器精密度良好。

表2 精密度考察結果

2.1.3 穩定性

按照“1.3.1.6”方法操作，發現女士保健酒中的阿魏酸在7.5 h內穩定，計算結果的阿魏酸峰面積RSD為1.49%，見表3。表明供試品溶液在7.5 h內的穩定性良好。

表3 穩定性考察結果

2.1.4 重復性

按照“1.3.1.7”方法操作，計算結果阿魏酸平均含量為0.006887 mg/mL，RSD為1.02%，見表4，表明本法重復性良好。

表4 重復性考察結果

2.1.5 專屬性

按照“1.3.1.8”方法操作，在陰性對照色譜圖中，阿魏酸保留時間處未檢測到色譜峰，表明方法專屬性良好，見圖2、圖3、圖4。

圖2 阿魏酸標準品HPLC圖

2.1.6 加標回收率

按照“1.3.1.9”方法操作，計算結果見表5，平均回收率為102.38%，RSD為1.41%。說明該方法滿足分析測定的要求。

圖3 女士保健酒供試品HPLC圖

圖4 阿魏酸專屬性HPLC圖

2.1.7 方法驗證

取3批女士保健酒樣品按“1.3.1.1”方法制備供試品溶液，并在“1.3.1.3”色譜條件下測定供試品溶液，每份樣品進樣2次，以平均峰面積計算阿魏酸含量，見表6。

表5 加標回收率實驗結果

表6 保健酒中阿魏酸含量測定

2.2 阿魏酸的穩定性（圖5）

由圖5可知，阿魏酸濃度在28 d內緩慢下降，在28 d后急劇下降，在42 d后下降速率降低，直至56 d以后降至為零。由于女士保健酒中的阿魏酸在加速試驗的3個月內不穩定，所以女士保健酒中的阿魏酸作為功效性指標不能支持24個月的有效期。

圖5 阿魏酸穩定性

3 討論

3.1 保健酒

保健酒穩定性研究在保健酒質量控制中是十分重要的，特別是含有不穩定成分的保健酒容易受各種環境條件如溫度、光照和存放環境等因素影響發生降解或轉化，隨著時間的延長導致其質量發生變化、功效性指標效價降低。在保健酒有效成分中，不乏穩定性較差的指標成分，對這一類成分的分析對于保證和評價保健酒質量具有十分重要的意義。

3.2 高效液相色譜法的建立

本研究建立了高效液相色譜法(HPLC)測定阿魏酸及其降解產物的分析方法用于測定阿魏酸的含量，方法簡單、快速、準確、靈敏度高。因此，本實驗以這一方法來測定阿魏酸，為表征含有阿魏酸這一成分的保健酒提供手段，為更進一步地研究阿魏酸的降解規律提供必要的數據支持。

根據女士保健酒多數藥材所含阿魏酸含量的特殊性，將檢測試驗適度優化。在藥典中指出檢測當歸中阿魏酸的方法，但是沒有提到流動相的流速和液相時長。經多次試驗發現，檢測女士保健酒中的阿魏酸采用0.8 mL/min的流速，使色譜中待測峰保留時間適中，峰形對稱，且與雜質峰有較好的分離。在色譜圖中顯示，阿魏酸在22.5 min左右出峰并在30 min后沒有雜峰出現，所以檢測時間選擇30 min。

3.3 方法驗證

根據阿魏酸藥理作用，選擇其作為一款具有美白祛斑、抗衰老類型的保健酒的指標性成分，充分證明保健酒的抗衰老和抑制黑色素生長的功效。本實驗經過色譜條件優化建立了檢測保健酒中阿魏酸的HPLC檢測方法，并對3批保健酒酒樣進行了檢測，經方法學驗證該方法專屬性、精密度、重復性、加標回收率、穩定性等均符合要求，可作為保健酒中阿魏酸成分含量快速準確的檢測方法。

3.4 阿魏酸穩定性的考察

保健酒研究中穩定性試驗結果以常溫穩定試驗的結果為準。但是在常溫下考核試驗耗時較長，不能及時掌握保健酒中功效性成分質量變化的速度和規律，也不易及時發現和糾正影響保健酒中功效性成分質量穩定性的條件和因素。本研究采用的恒溫恒濕加速試驗法研究女士保健酒中阿魏酸的貯藏穩定性，在較短時間內預測了女士保健酒中阿魏酸在常溫條件下的質量穩定性，大大縮短了實驗時間。

本研究以阿魏酸為代表對女士保健酒穩定性進行深入的研究，目前已有研究和文獻報道了阿魏酸不穩定，然而在現有的質量控制條件下常常作為保健品的主要有效成分或指標成分之一，是因為它具有抗氧化、清除自由基、抑制血小板聚集和血栓形成等作用。通過研究明確了阿魏酸是否能作為女士保健酒的功效性指標。由于在加速試驗中，28 d后阿魏酸含量急劇下降，56 d后阿魏酸含量過低，因此說明女士保健酒中的阿魏酸含量在常溫下不能維持2年的穩定狀態。