生物酶法提取葡萄皮渣多酚工藝研究

海 玲，張愛棟，張爾珂，豆彤彤，楊學山

（甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅蘭州730070）

甘肅省河西走廊氣侯較為干燥，晝夜溫差較大，日照強，土壤呈沙性，富含鈣質，非常適合釀酒葡萄的種植與生產[1]。隨著葡萄產量的增長和葡萄加工業的迅猛發展，葡萄酒釀造的副產物（葡萄皮、籽和果梗）迅速增長[2]。目前，除部分釀酒葡萄皮渣被用作肥料、飼料，大部分被閑置廢棄，資源化利用率較低，且造成了環境污染，嚴重制約了甘肅葡萄酒產業的可持續發展。

葡萄皮渣中含量豐富的多酚類化合物具有較強的抗氧化活性，能夠降低炎癥，抑制腫瘤發展，具有促凋亡和抗血管生成作用。此外，多酚類物質還能夠增加毛細血管阻力，保護心血管系統以及視網膜[3-5]。近年來，雖然有機溶劑提取法已大量應用于多酚物質的分離純化，但易造成二次污染，從而制約了葡萄皮渣提取物在醫藥、食品、化妝品等行業的應用[6-7]。與傳統提取法相比，酶法提取反應條件溫和，綠色無污染且選擇性強，纖維素酶可破壞植物的細胞壁，有利于植物生物活性物質的提取[6]。據文獻報道，酶法已成功應用于黑加侖茶多酚[5]、石榴籽[7]、葡萄籽[8]和山楂葉[9]等不同植物基質中多酚物質的提取，而關于纖維素酶解提取葡萄皮中多酚物質的研究則少見報道。

本研究以甘肅河西走廊產區釀酒葡萄主栽品種赤霞珠（Cabernet Sauvignon）釀酒后的皮渣為原料，采用纖維素酶法提取其中的多酚物質，通過單因素結合正交實驗，優化提取工藝參數，以期為葡萄皮渣多酚化合物的開發利用提供可行依據。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

原料：赤霞珠葡萄皮渣，采自甘肅農業大學食品學院葡萄酒生產車間。

試劑：纖維素酶（上海源葉生物科技有限公司，酶活力400 U/mg）、Folin-Ciocalteus。

顯色劑、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、沒食子酸等均為分析純。

1.2 儀器與設備

PHS-3C PH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；TU-1810紫外-可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；TD5A-WS臺式低速離心機（東莞康潤實驗科技有限公司）；CPJ214電子天平；恒溫水浴箱等。

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄皮渣多酚的提取

將酒精發酵結束后的赤霞珠葡萄皮渣去籽，置于鼓風干燥箱中60℃干燥24 h，經超碎粉碎機得到葡萄皮粉末作為實驗原料，于4℃冰箱中儲存備用。采用纖維素酶酶解、水浴浸提多酚類物質。

1.3.2 葡萄皮渣多酚的測定

采用福林-肖卡法[10]測定葡萄皮渣多酚。吸取1 mL樣品溶液，加入5 mL蒸餾水、1 mL Folin-Ciocalteus顯色劑和3 mL 7.5%Na2CO3溶液。避光室溫下放置2 h顯色后，在765 nm波長下測定吸光度，再根據標準曲線方程（y=0.116x-0.02，R2=0.9995）計算樣品中多酚的質量濃度。葡萄皮渣多酚得率按以下公式計算：

式中：ω為多酚得率，%；C為根據標準曲線計算得到的多酚質量濃度，μg/mL；V為提取液的體積，mL；m為葡萄皮渣的質量，g。

1.3.3 單因素實驗設計

1.3.3.1 纖維素酶添加量對多酚得率的影響

準確稱量葡萄皮粉末0.500 g，分別加入質量為10 mg、15 mg、20 mg、25 mg、30 mg的纖維素酶，在酶解溫度50℃，pH 5.0的條件下酶解2 h，離心10 min后取上清液，測定不同纖維素酶添加量下得到的葡萄皮渣多酚的得率。

1.3.3.2 酶解液pH值對多酚得率的影響

固定纖維素酶添加量，調節酶解液pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，其他操作同上。測定多酚得率，選出較佳酶解pH值。

1.3.3.3 酶解時間對多酚得率的影響

固定纖維素酶添加量和酶解pH值，設置酶解時間分別為1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，其他操作同上。測定多酚得率，選擇較佳酶解時間。

1.3.3.4 酶解溫度對多酚得率的影響

固定纖維素酶添加量、酶解pH值和酶解時間，設置酶解溫度分別為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，其他操作同上。測定多酚得率，選出較佳酶解溫度。

1.3.4 正交實驗

根據單因素實驗結果，選取酶添加量、酶解pH值、酶解時間和酶解溫度作為實驗因素，采用L9（34）正交表，做4因素3水平實驗。通過對各組樣品多酚得率的測定，選出最佳工藝條件。實驗因素和水平設計見表1。

表1 正交實驗因素和水平

1.3.5 最佳工藝條件的驗證

按照正交實驗優選的各參數，進行葡萄皮渣多酚最佳提取條件的驗證。

1.4 數據處理與分析

采用Excel 2010和SPSS 20.0處理數據并作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 纖維素酶添加量對多酚得率的影響（圖1）

圖1 不同酶添加量對多酚得率的影響

由圖1可知，隨著纖維素酶添加量的不斷增加，葡萄皮中多酚得率呈現先上升后下降的趨向，其中酶得率為20 mg時，多酚得率達到最大值。結果表明，隨著纖維素酶添加量的增加，葡萄皮細胞壁的破碎程度進一步加大，從而更有利于細胞內多酚物質的溶出；當酶得率繼續增加時，由于其底物濃度不足，使過多的酶聚集于皮渣表面，從而阻礙了細胞內多酚物質的擴散和溶出，使多酚得率下降[10]。因此，纖維素酶的較佳添加量為20 mg。

2.1.2 酶解液pH值對多酚得率的影響（圖2）

圖2 不同酶解pH值對多酚得率的影響

由圖2可知，當pH值增加至5時，多酚得率達到最大值，之后隨著pH值的繼續增大，多酚得率迅速降低。這是由于pH值會影響纖維素酶的活性中心，在pH5時，酶催化的活性中心最易與底物相結合，促進了細胞破碎，從而提高了胞內物質的溶出比例。而當pH值發生變化時，酶雖不會變性失活，但酶活性中心部位發生改變，從而降低酶活力，影響多酚物質的充分擴散，使得率下降[11]。

2.1.3 酶解時間對多酚得率的影響（圖3）

圖3 不同酶解時間對多酚得率的影響

如圖3所示，隨著酶解時間的逐漸延長，葡萄皮中多酚得率不斷增加，當酶解時間達2 h后，隨時間的延長多酚得率逐漸降低。在1.5～2.5 h時，隨著時間的延長，葡萄皮細胞壁及細胞間的阻擋層已被有效水解，使多酚物質充分溶出[12]。而過長的處理時間易引起多酚物質的氧化分解，使提取量降低，因此選擇酶解時間為2 h，此時效果較好。

2.1.4 酶解溫度對多酚得率的影響（圖4）

圖4 不同酶解溫度對多酚得率的影響

由圖4可知，纖維素酶提取葡萄皮中多酚的較適作用溫度是55℃。在55℃之前，隨著溫度的不斷升高，細胞內活性物質分子運動速率和酶促反應隨之加快，破壁作用加強，使多酚物質充分釋放于提取液中[13-14]；隨后，溫度的繼續升高易使多酚物質分解，還會破壞酶的結構，使酶活性下降，從而影響多酚得率。由此選擇55℃為較好的提取溫度。

表2 正交實驗結果

2.2 正交實驗結果

為確立酶法提取葡萄皮渣多酚的最優工藝，根據單因素實驗結果，進行L9（34）正交實驗，正交實驗結果見表2。為判斷上述4種因素對實驗結果的影響程度，應用SPSS20.0對正交實驗結果進行方差分析，利用F檢驗判斷各因素對實驗指標的影響程度，結果見表3。

表3 方差分析表

由表2可知，影響赤霞珠葡萄皮中多酚提取量的主次因素依次為C＞B＞D＞A，即時間＞酶解pH＞酶解溫度＞酶添加量。由表3方差分析可知，因素B和因素D顯著，因素C極顯著，即pH值、溫度和時間對葡萄皮渣多酚的得率均具有顯著性影響，而酶添加量對其無顯著性影響。纖維素酶提取葡萄皮渣多酚的最佳組合為A3B2C2D1，即酶添加量25 mg，酶解pH5，酶解時間2 h，酶解溫度50℃。

根據正交實驗所得的最優組合（A3B2C2D1）進行驗證實驗，實驗結果表明，在此工藝條件下提取得到的葡萄皮中多酚得率達到11.238 mg/g，均高于正交實驗結果，表明本試驗優化的工藝條件有較好的可行性。

3 結論

通過單因素結合正交實驗優選赤霞珠葡萄皮渣多酚的提取工藝參數為酶添加量25 mg，酶解液pH5，酶解時間2 h，酶解溫度50℃。該法有效縮短了提取時間，節約了成本，而且多酚結構不易被破壞，與傳統提取方法相比，提取溶劑綠色、安全、無污染，具有一定的推廣和應用價值。