醬香型白酒釀造過程中微生物及其代謝產物研究進展

戴奕杰，李宗軍，田志強，孟望霓

（1.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙410128； 2.貴州省產品質量監督檢驗院，貴州貴陽550016）

中國白酒作為世界著名蒸餾酒之一，其獨特的固體發酵劑及其制備方法、悠久而底蘊深厚的發酵工藝、復雜而協調的酒體風味是世界其他蒸餾酒無法比擬的。中國白酒分為四大基礎香型——濃香、醬香、清香、米香，之后通過不斷的工藝融合和技術創新，以此四大香型為基礎又逐漸形成了芝麻香、兼香、鳳型、特型、老白干、豉香等共計十二大香型。其中，以茅臺為代表的醬香型白酒因其獨特的品質而廣受國內外消費者的好評。同時，其復雜的“九次蒸煮，八次發酵，七次取酒”生產工序中所蘊含的微生物代謝作用機理及物質變化過程一直是業內所研究的重點。

醬香白酒釀造工藝中高溫大曲制作、堆積發酵、窖內糟醅發酵等過程實質上等同于體系微生態的變化，此微生物區系與同體系內的能量轉換及物質傳遞緊密結合，從而發生變化。目前，現代生物前沿科技及人工智能已經運用于醬香白酒的生產過程研究，如微生物測序技術、微生物組學技術、代謝組學技術、生物傳感技術、人工智能調香技術等，這些技術的運用逐步揭示了醬香白酒生產過程中的微生物演變及酒體風味物質組成。

1 醬香型白酒釀造工藝概述[1]

醬香型白酒風味特點重在突出一“醬”字，業內將其感官特征總結為“微黃透明、醬香突出、幽雅細膩、酒體醇厚、回味悠長、空杯留香持久”。這幾個字凝結的是無數代釀酒工作者的心血，傳承的是華夏“醬酒”的精髓之處。醬香型白酒的生產工藝的特點為“四高兩長，一大一多”，即采用高溫制曲、高溫堆積、高溫發酵、高溫餾酒、生產周期長、貯存時間長、大用曲量和多輪次發酵。這樣的工藝使得醬香型酒的香型和風格與我國其他白酒迥然不同。關鍵工序見圖1。

圖1 醬香白酒生產部分關鍵工序圖示

糟醅高溫堆積的過程實質是富集各種有益微生物，淘汰一部分雜菌，由此進入多輪次的發酵，產酒的同時也生成多種風味物質，再經高溫餾酒工序，使得酒精蒸出的同時也將發酵過程中所生成的高沸點、水溶性的醬香物質（如酸、醇、氨基酸等）富集于酒液中，形成酒體醬香風味。基酒通過長時間的貯存，再經勾兌后貯存一段時間便可作為成品酒包裝出廠。醬香酒獨特的生產工藝造就其獨樹一幟的品質，離開這基本工藝就釀不出高品質的醬香酒，實質是對工藝的研究，這樣才能保證研究內容及成果和實際相符。

2 醬香酒功能微生物研究概況

2.1 醬香酒酒曲微生物類群研究

通過查閱文獻[2-12]，比對醬香高溫大曲、濃香中溫大曲、清香低溫大曲中微生物多樣性，見表1。

從文獻報道可看出[2-12]，醬香高溫大曲中芽孢桿菌種類較多，而正是由于高溫工藝，使得部分真菌無法有效繁殖富集；濃香中溫大曲中芽孢桿菌明顯沒有醬香大曲的多，但霉菌及酵母的數量比醬香大曲多，種類也更為豐富，這是因為其制曲溫度較低，適合真菌的繁殖富集；清香型低溫大曲中微生物種類相對前兩者要少。3種不同香型白酒釀造中有些微生物是共有的。據報道[13]，細菌、酵母、霉菌在糖化、產酒、酒質等方面均具有明顯的相互作用，并且以三者為基礎制成微生物菌劑應用于實際生產，在出酒率和酒體風味物質上都有顯著的提高。此類研究揭示著中國白酒各香型間是具有相互聯系的，而微生物的共性研究可以為探索相互間的關系提供路徑。

表1 不同香型大曲中微生物多樣性比較

2.2 醬香白酒釀造過程中的細菌

中國傳統白酒的生產是處于開放式的環境，環境微生物對釀酒的影響至關重要，細菌在中國白酒的釀造中扮演著重要的角色，從產香、生香作用上來說，細菌對醬香白酒的釀造尤為重要，比如產酯香功能細菌可明顯提高酒醅的蛋白酶活力、氨態氮含量和酯化力[14]。以茅臺成品大曲為例，其中90%的微生物為細菌，數量可以達到107個/g曲[15]，所以其又被稱為“細菌曲”[16]。細菌廣泛存在于醬香白酒制曲、堆積、酒醅發酵等工藝過程中，主要以芽孢桿菌屬、乳酸菌屬、醋酸菌屬、梭菌屬等為主[17]。醬香高溫大曲因制曲溫度高達60℃，所以帶入的細菌亦為嗜熱細菌[18]。此部分細菌活躍于高溫大曲中，產生豐富的呈香前體物質，以大曲作為媒介帶入到醬香白酒的整個釀造階段，后經堆積發酵、窖池發酵，再次富集培養環境中更多的微生物，于體系中形成醬香酒獨特的微生物菌群結構[19]。有研究報道[20]，大曲中細菌群落結構多樣性高于堆積酒醅，而且對于高溫堆積工序，同一輪次中變化趨勢為：堆積中期＞堆積后期＞堆積前期。經研究證明[21]，芽孢桿菌是醬香白酒生產中的主要產香功能細菌，它可分泌豐富的酶系，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等，作用于小麥、高粱等釀酒原料進而產生豐富的氨基酸、糖類等物質，再通過后續系列的生化反應生成具特殊風味的芳香類化合物。另據研究報道[22-24]，醬香高溫大曲制曲過程中多種游離氨基酸可發生美拉德反應，促進醬香風味的形成，而芽孢桿菌推動了此反應的進行。

2.2.1 細菌群落結構的變化研究

研究醬香白酒生產過程中細菌群落結構及種類數量上的變化，以及與環境之間的內在聯系，可為揭示醬香風味形成機理提供理論指導。細菌廣泛存在于制曲及其制酒過程中，王曉丹等[26]對3種不同醬香高溫大曲中細菌群落組成進行研究，其中地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)數量在芽孢桿菌中遠高于其他細菌。在楊代永的研究中也證實醬香高溫大曲中含有豐富的地衣芽孢桿菌，其芽孢桿菌總數可達到2.118×107cfu/g曲[2]，并且多數為適宜60～65℃下繁殖生長的嗜熱菌。唐玉明等[25]對醬香白酒輪次生產過程進行跟蹤研究，結果表明，好氧細菌數量發酵初期可最高達107個/g糟，發酵中期減少到105個/g糟，其中，好氧芽孢桿菌基本維持在104～105個/g糟，兼性厭氧菌及其芽孢桿菌在入窖初期數量略有降低，中期出現低谷，整個發酵過程平均維持為104個/g糟，這與楊代永總結的細菌在制曲過程中符合“前期達到峰值，中期回落，后期回升”的結論一致。

細菌與多種醬香前體物質的生成之間具有緊密聯系，有研究表明[27]，乳酸菌與乳酸、乙酸等酸類物質的生成存在顯著關聯，芽孢桿菌與酸類物質、含氮化合物之間相關性顯著。關于此，江南大學作了深入的研究，徐巖[13]報道，醬香型白酒中檢測出了高含量的四甲基吡嗪，并通過實際生產運用證實其可增強酒體“空杯留香”的特點。據報道[15]，醬香大曲中產酶細菌主要集中為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌等，其中枯草芽孢桿菌具有明顯的蛋白酶活力，并部分具有淀粉酶活。也有研究報道已證實，四甲基吡嗪并非是美拉德反應生成的[29]，故總結以上研究結論，結合四甲基吡嗪可增強醬香酒體“空杯留香”特點及枯草芽孢桿菌可高產四甲基吡嗪的特型，推測枯草芽孢桿菌產蛋白酶特性對于生成醬香白酒特征風味物質——四甲基吡嗪具有一定作用。

醬香白酒釀制過程中細菌的群落變化還與周圍環境因素相關。黃治國等[28]利用PCR-DGGE技術研究不同地域醬香型酒醅中優勢細菌群落結構的差異，研究表明，不同細菌群間存在著共生或競爭的關系，因地域環境、工藝、水質等的不同，酒醅細菌群落多樣性及相似性均不同。亦有報道[22]，不同區域醬香型白酒窖底泥的細菌多樣性主要受pH值、速效鉀、水分的影響，且在一定范圍內與速效鉀呈負相關，與pH值和水分含量呈正相關。因此，不同區域內所形成的細菌群落結構也不盡相同，這也是醬酒生產離不開特定條件環境的重要原因之一。

2.2.2 細菌產酶特性研究

白酒釀造過程中酶類起到分解原料、促進體系內生化反應的作用。醬香白酒生產過程中可監測到的酶類主要為酸性、中性蛋白酶，以及淀粉酶、酯化酶、纖維素酶、果膠酶等，其中大多數酶類可由細菌分泌獲得[30]。因此，醬香白酒釀造過程中體系內酶系的變化及作用機制一直是業內的研究熱點，其中細菌產酶功能研究是一大重點。枯草芽孢桿菌具有較強蛋白酶活，地衣芽孢桿菌具有酸性蛋白酶活，且在50℃下還具有較高的酶活，蠟狀芽孢桿菌具有較高的內切纖維素酶活力和外切纖維素酶活力，并且亦耐高溫[31-32]。另有報道[33]，微生物纖溶酶有可能作為預防血栓栓塞類疾病的配方使用，并且枯草芽孢桿菌可以分泌有效的纖溶酶，林芬等[34]通過發酵聞香及酪蛋白分解酶活測定，從不同酒廠的酒曲、酒糟、窖泥中分離篩選出20株產香好、蛋白酶活高的細菌，進一步測定了其中9株有較高的纖溶酶活力，其中最高可達1479.11 U/mL。總之，對細菌分泌的酶類及其在體系中的作用機理進行探討研究，不僅有助于分析醬香風味物質成分，還利于使用基因工程技術選育優良產酶功能菌株，為醬香白酒的規模生產和提高優級基酒出酒率提供科學指導[30]。另外也可以從其他學科中獲取信息，通過深入挖掘產醬香細菌中可用于生物酶制劑、醫療、保健食品等行業的功能，從而創造新的科研運用價值。

2.2.3 細菌強化大曲研究

眾多研究表明，芽孢桿菌是醬香風味形成的關鍵功能微生物，因此，利用細菌純培養技術，將1株或多株產香芽孢桿菌移殖入制曲過程中進行培養，以此起到強化大曲的作用，借以豐富及提高后續發酵風味物質的種類和含量。對此，業內不斷對細菌強化大曲進行相關研究。趙希玉等[79]利用從茅臺酒釀造微生物中篩選出的6株產醬香細菌制成細菌曲，并加入到制酒過程中，試驗結果表明，加入細菌曲的產酒質量明顯有所提高。楊濤等[35]將醬香大曲中所分離到的地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等按一定比例混合制成三級種子液，后在拌料階段加入到制曲過程，試驗所得強化大曲的液化力、蛋白質水解力均有明顯升高，并且大曲中游離氨基酸含量有所提升，運用到釀酒階段時，糟醅的各項理化指標均有提升，釀制酒液的品質優良。孟天毅等[36]對本公司生產車間的強化高溫大曲進行了分析研究，結果表明，強化大曲的微生物構成與成品曲基本一致，且強化大曲的醬香風味更加突出，而成品曲則是曲香突出；強化大曲產酒醬香更加濃郁、酒體爽凈，而成品曲則顯得更加豐滿、醇厚。

上述研究證實，醬香大曲中確實存在生產中起到主導作用的細菌，將這些具重要功能的細菌分離，并通過一定工序植入大曲中培養富集，確實可以起到強化大曲的作用，進而達到提高產酒質量的效果。不同添加菌株及不同工藝下所生產的強化大曲，對傳統醬香白酒釀造的“強化點”及“強化程度”均有所不同，對酒質的影響也不一樣[37]。對強化大曲的研究及實踐運用，可真正實現科研與生產的接軌，讓科研成果能夠為生產服務，降低能耗、提高產量，對實現行業集約型生產意義重大。

2.3 醬香酒釀造過程中的酵母菌

酵母菌在日常生活中隨處可見，酸奶、面包等發酵性食品的生產過程中均是酵母菌在起著主導作用，同樣，酵母在釀酒過程中是不可或缺的。在醬香大曲制曲過程的高溫環境下，酵母菌無法生存，所以整個制曲過程無法富集周邊環境內酵母菌[38]。酵母菌的帶入及富集主要是在堆積發酵過程中，酒醅在開放式的生產環境下與空氣接觸，酵母菌通過空氣及生產器具作為媒介進入酒醅中，再通過不斷繁殖，成為體系內除細菌、霉菌外的主要功能微生物[40]。酵母菌可于堆積發酵酒醅中大量分離得到，主要有球擬酵母、假絲酵母、漢遜酵母等，是參與發酵產酒產香的重要微生物[39]。按功能的差別，醬香白酒生產中的酵母菌可分為釀酒酵母和生香酵母，前者有較強的產酒精能力，后者則是可以酯化酸類、醇類等物質，產生以乙酸乙酯為主要酯類的風味物質，提升醬香白酒品質[19]。

2.3.1 酵母菌種類及數量變化研究

不單對于醬香白酒，對于其他香型白酒來說，酵母菌都在出酒率、產香、酒體品質等方面展現出其重要的作用[41]。因此，研究酵母菌在醬香白酒生產中的群落結構變化及相應的生化反應機制，對于揭示醬香白酒釀造過程中科學內涵具有重大意義。唐玉明[25]及印璇等[42]的研究均證實，在窖池發酵的過程中，上層糟中酵母數量一直略高于中、下層，且酵母菌的數量隨著時間的延長而呈現下降的趨勢。兩者的研究均說明窖池發酵時已經不再是酵母的繁殖及富集階段，而制曲階段的高溫環境不利于酵母菌的生長繁殖，故推測酵母菌主要仍是通過高溫堆積階段帶入。

有研究曾對醬酒生產過程中的酵母菌變化作了較為全面的研究[43]，結果表明，高溫大曲中可以檢測出極其少量的酵母菌，主要為漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)和扣囊復膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)2種；而在高溫堆積發酵階段，酵母數量則穩定維持在106～107cfu/g，酒醅中包含絲孢酵母(Trichosporon coremiiforme)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、庫得畢赤酵母(Pichia kudriavzevii)、粉狀畢赤氏酵母(Pichia farinosa var.farinose)等共12個種，整個生產工序中酒質好的第4輪、第5輪次酒醅中，酵母數量明顯多于后續的輪次；大部分酵母菌具有產多元醇的能力，并且還可以代謝出苯乙醇、4-乙基愈創木酚、4-乙基苯酚、芳樟醇等物質。由此可以看出，酵母菌幾乎存在于釀酒的各個工序中，酒醅中包含的酵母菌是最豐富的，并且可以代謝產生多種醇類化合物，對醬香白酒的呈香具有推動作用。

2.3.2 酵母菌在發酵過程中生長特性研究

酵母菌作為釀酒中的必不可少的成員之一，其生長特性、環境適應性，以及與體系中其他微生物共生關系的研究一直是業內熱點。已有多篇文獻報道證實酵母菌具有良好的耐高溫、耐受pH值、耐酒精濃度的特性[44-45，47]，也有多種酵母菌被分離，并證實其具有產酒及產多種化合物功能。其中莊孝杰等[44]從醬香酒醅中篩選得到1株性狀優良的拜耳接合酵母(Z.bailii15)，該菌酒精產量可達到33.58 g/L，并且與模式菌株相比較可多產十二醇、月桂酸、辛酸乙酯、苯乙酮、4-叔丁基苯酚等多種物質，且同酒醅分離的地衣芽孢桿菌在37℃條件下可抑制其生長繁殖。路曉偉等[45]從醬香酒醅中分離篩選出1株性能優異的釀酒酵母MT1，該菌乙醇轉化率也要高于其他菌株，經發酵產物鑒定，一些風味物質成分如2,3-二氫苯并呋喃、4-乙烯基愈創木酚、法尼醇、橙花叔醇、乙偶姻和大馬酮等都有在MT1中檢測出，并且與對照菌株相比，有少部分物質是只有該菌才代謝產生。以上報道均體現出酵母菌高產酒精的特性，并且從所產物質種類來看包含酸類、酚類、芳香族、酮類多種，體現出酵母在產香方面也具有一定的作用。

釀酒酵母作為酵母菌的模式菌株，在研究酵母菌與其他微生物共生關系時都將其列為研究對象。孟醒[46]研究了釀酒酵母與地衣芽孢桿菌的相互作用分子機制，研究表明，釀酒酵母在低pH值環境下可抑制地衣芽孢桿菌的生長。白夢洋等[47]研究了釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae，Sc）和畢赤酵母菌（Pichia fabianii，Pf）之間的相互影響，混合菌條件下，后者對前者有明顯抑制作用，而Pf細胞代謝產生的亞油酸和亞麻酸可能是抑制Sc生長的因素。

從以上研究可以看出，醬香白酒生產過程中酵母菌的特性各有差異，但都具有一定的耐高溫、耐酸、耐酒精濃度的特性，這與醬香白酒生產中體系溫度較高，酒醅具一定酸度、酒精濃度較高相關，正是因為這些工藝條件，在漫長的傳統工藝釀造過程中馴化了周圍的酵母菌，使之適應醬香白酒的生產。酵母菌在體系中會與其他微生物產生拮抗作用，其中有些作用利于反應正向進行。酵母菌的發酵風味物質較為豐富，多篇研究報道也證實了這一點[15，19，41]，并且通過某些基因的敲除，可使其代謝產物含量和種類達到可控。

2.3.3 酵母菌在各輪次中的變化研究

醬香白酒生產過程各個輪次的產酒情況均不一樣，工藝中有“掐頭去尾”的說法。其中，中間輪次的產酒酒質明顯優于后面輪次的，結合其生產工藝中的多輪次固態發酵，研究其中微生物特別是細菌、酵母菌等的種群結構變化，對于揭示各輪次酒質差別的深層次原因具有實際參考價值。邵明凱等[41]利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)和實時熒光定量PCR(RT-q PCR)技術，對醬香白酒生產過程中產量較高、酒質優良的第5輪次和較差的第7輪次工藝中酒醅進行了酵母群落結構的分析研究，并對風味成分進行了檢測，結果表明，第5輪和第7輪中分離出的酵母優勢菌種有差異；第7輪次發酵后期發現酵母菌有明顯衰亡的現象，第5輪次則相對穩定，且后者酵母含量是前者的2～5倍，乙醇含量也要高出2倍多；第5輪次酒醅發酵產物中酯類高于第7輪次，而有機酸和雜醇油含量低于第7輪次。孫劍秋等[48]采集北大倉酒廠生產中不同階段的發酵窖池酒醅，分離獲得大量酵母菌，再基于26S rDNA D1/D2區域的堿基序列準確鑒定酒醅中的酵母菌，從而研究其中酵母菌群落結構，結果表明，酵母菌數量在釀造過程中遵循著“升高-降低-升高-降低”的規律，各個輪次的升降幅度及速度不同，且各輪次中酵母菌的組成及分布具有相似之處。吳徐建[49]追蹤研究了醬香型白酒第2輪至第7輪次釀造體系中酵母菌群落結構，共鑒定出16個酵母種屬，結果表明，不同輪次起始時酵母含量相差可達到452倍，但發酵結束時差別縮小至10倍左右；窖池發酵中上層、中層、下層酒醅酵母類別基本一致，主要為Z.bailii、Schizosaccharomyces pombe、S.Cerevisiae，這些菌株對醬香白酒風格形成具有一定作用。從以上研究報道可以看出，酵母菌在各輪次發酵過程中數量上均有所差異，因地而異，有的只有幾倍的差距，有的卻可以高達幾百倍的差異。共同點是酵母菌都會隨著發酵時間的延長而逐漸衰亡，其在產乙醇、產香方面的作用突出，特別是在中間輪次的發酵過程中尤為明顯。

2.4 醬香酒釀造過程中的霉菌

醬香白酒釀造過程中可分離出的主要真菌，其一為酵母菌，其二便是霉菌。霉菌的主要功能主要是分泌糖化酶、液化酶及蛋白酶，對分解釀酒原料中的淀粉、蛋白質等大分子物質具有積極的推動作用，使得整個反應體系中糖類及氨基酸含量升高，可為其他微生物的代謝提供基礎物質，亦為后續的酒體風味形成奠定基礎[50，21]。在醬香大曲制曲過程中，由于水分含量少、高溫、缺氧，不利于霉菌的生長富集，所以其中檢出的霉菌較少[40]。霉菌的主要來源為空氣、場地、原輔料、母曲及人體，它們的數量可達6.446×106cfu/g曲[2]。業內對于霉菌的研究，主要集中在其酶活性能、菌群結構、蛋白質組學、發酵性能等方面，同時還認為霉菌具有調節糖化、發酵和生香的作用，對醬香白酒釀造過程中霉菌多樣性、生長代謝過程及其發酵風味產物的研究，可以為揭示醬香風味形成機理提供可行途徑。

2.4.1 霉菌在釀造過程中種類的研究

霉菌的大量富集是在大曲的儲存及堆積發酵的過程中，其數量及類群在體系中占比較大[17]，并且以毛霉、曲霉、青霉居多[15]，有報道稱茅臺大曲中可分離出的霉菌就達到40多種[51]。有研究報道了南方、北方醬香高溫大曲中霉菌含量的差異，南方高溫大曲中霉菌數量高于北方100倍[52]，推斷這是由于南北氣候、溫差、地貌等環境因素的不同而導致的，也是南北方所釀造的醬香白酒品質具有差異的一大因素。據陳筆[53]的分析報道，在高溫堆積階段霉菌是呈上升趨勢的，從堆積初始的3.4×103cfu/g增加到第3天的1.28×104cfu/g，后一直下降至發酵結束時不到1.0×103cfu/g，同樣孫劍秋的研究中也證實了窖池內部霉菌數量從發酵初期開始即急劇下降，與同為真菌的酵母菌變化相似[48]。亦有研究報道[54]，醬香大曲制作過程中在儲存前1個月內霉菌呈上升趨勢，最大值可達到4.5×105cfu/g，后隨著儲存時間的延長逐漸下降。有報道稱[53]，A.oryzae(米曲霉)和P.variotii(擬青霉)是發酵過程中的優勢霉菌，具有較高的糖化酶和α-淀粉酶酶活，將米曲霉和釀酒酵母在不同條件下混合發酵，能夠提高體系的酯類、酸類、醇類、醛酮類等風味物質的濃度，且酒體中重要的風味成分化合物乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、3-甲基-丁醇、乙酸等有較明顯的提高。據此可以看出，醬香酒大曲儲存及酒醅高溫堆積階段是霉菌重要的富集過程，霉菌和酵母之間可能存在相互促進物質催化反應的機制，使得產酒組分得以豐富提高。

2.4.2 霉菌產酶特性研究

醬香酒風味物質的形成與體系內酶系的組成含量密不可分，生產過程中原料本身所帶有的酶是非常少的，大多數都是靠體系微生物分泌而來，而霉菌本身可以產生多種酶類，據報道，醬香酒醅中分離的霉菌以紅曲、毛霉、地霉、擬青霉等為主，其中曲霉和青霉產生的功能酶類較多，種類也較為豐富[48]。HEIN I等[55]對青霉的分泌酶系進行了研究，結果顯示青霉可以產聚糖酶系，這使得釀酒原料中的木質纖維可以被降解，對于高效利用原料，提高出酒率具有一定的促進作用。班世棟[56]對不同樣品曲儲藏期的酶活進行測定，發現各種水解酶在大曲儲藏過程中的變化趨勢不同；分離出了19株霉菌，其中構巢曲霉、分枝犁頭霉、離生青霉和溜曲霉同時產生的多種酶活都較高。黃永光[57]從醬香白酒酒醅中獲得了1株高產糖化酶和蛋白酶的功能曲霉，其分泌酸性蛋白酶組分AP2和AP3，將AP3運用到發酵過程中，可使酒醅風味物質含量提高183.94%，醇類、酸類、酯類和芳香族化合物提升明顯，證實了霉菌產蛋白酶對風味物質的形成具有關鍵作用。有研究表明[58]，霉菌可代謝產生檸檬酸、草酸等有機酸，曲霉代謝可產生具抑制癌細胞活性的壺角甾醇，所以推測霉菌對醬香白酒風味形成及保健功能具有一定作用。另有報道稱[51]，霉菌和酵母間在產酶方面有不同的促進或抑制作用，相同的2株菌在不同的環境條件下也可能出現共生或競爭2種不同結果，這也反映了在釀造過程中微生物之間相互作用的復雜性。

以上研究表明，霉菌在醬香白酒釀造過程中分泌糖化酶、蛋白酶等多種酶類，發揮糖化作用的同時也在促進多種風味物質的形成，為醬香風味的形成提供物質基礎。同時霉菌還可以在一定程度上利用釀酒原料中不易被分解的纖維素，在提高原料使用率方面可起到一定作用。

3 醬香白酒釀造過程中微生物代謝產物研究

3.1 酒曲微生物及其生物轉化過程

醬香白酒高溫大曲是個復雜的微生態系統。在酒曲品質形成過程中，酒曲微生物與酒曲原料轉化、培曲環境之間存在著復雜的生態學關系，詳見圖2。

目前，制作醬香高溫大曲的原料主要是小麥，小麥中主要含有蛋白質、淀粉、纖維素，微生物的作用即是分解此3種組分，進而通過各種生化反應生成風味物質。在大曲中酵母菌分泌的蛋白酶均為酸性蛋白質，特別是那些以單分子氨基酸為終產物的蛋白酶。這類酶只有在酵母菌溶解后才會表現出活性，對白酒的風味形成具有重要意義。而酵母菌自溶后釋放出來的營養成分又可作為其他微生物生長的養料[59]。曲霉屬如米曲霉等分泌的蛋白酶和細胞溶解酶可將不溶性的大豆和小麥成分分解成水溶性的多肽、糖、游離氨基酸等物質[60]。在毛霉和根霉等分泌的淀粉轉葡糖苷酶的作用下，淀粉轉化為低分子糖類、少量乙醇等物質[61-62]。木霉屬參與纖維素和淀粉降解，紅曲霉屬參與酯質合成，根霉屬還參與揮發性物質合成[62]。甘露醇是以甘露糖為基質，在霉菌分泌的甘露醇脫氫酶作用下縮合而成，也可以果糖為基質，在甘露醇脫氫酶作用下縮合而成[63]。甘露醇是一種生物滲透保護劑，對大曲具有保護作用，同時還可作為儲備碳源或是活性氧清除劑[64]。在酒曲發酵過程中，含硫氨基酸經降解、縮合生成含硫化合物如香葉基丙酮、大馬刺酮、千內酯等，對白酒風味形成具有重要影響[65]。

圖2 酒曲微生物、原料轉化以及發酵產物之間的生態學過程

3.2 醬香白酒釀造過程中微生物與醬酒風味的關系

醬香白酒中特征風味物質的研究在近年來得到業內的重視，但是由于其復雜性，一直沒有定論。于此，業內主要有4-乙基愈創木酚、吡嗪類化合物、吡喃類和吡喃類衍生物、高沸點酸類等幾種假說[40]。有研究報道[39]，經高溫堆積與不堆積的酒醅在酯類、醇類、酸類物質上含量相差較大，高溫堆積的酒醅各物質含量均比不堆積的高出很多，這也證明了高溫堆積工序在整個醬香白酒釀造工藝中的重要地位；不堆積及堆積不好的酒醅，無法為后續過程提供豐富的微生物區系、酶系及風味前體物質；醬香酒中雜環類物質含量比其他香型要高。醬香大曲中酸性組分所占比例最大（90%左右），且也具有較高含量的吡嗪類、酚類和芳香化合物[66]，而堆積酒醅中醇類及酯類均有較大占比[67]。

3.2.1 細菌產香研究

如前所述，醬香高溫大曲中芽孢桿菌的數量占較大比例，并且必須要在高溫制曲環境下才能富集這些嗜熱細菌。普遍認為，芽孢桿菌是產醬香風味的主要功能細菌，比如有報道稱醬香白酒中具有較高含量的地衣素，該物質在保留醬香白酒酒體中相關風味物質方面起到重要作用，產生該類物質主要即為芽孢桿菌[71]，所以對醬香酒釀造過程中細菌發酵代謝產物的研究也是業內熱點。武思齊[68]對實驗中所篩選的產醬香風味芽孢桿菌發酵風味產物進行研究，結果表明，隨著溫度的升高，其發酵產物種類及含量均有所提升；經質譜檢測出27種化合物，包括醛、醇、吡嗪、高級烷烴等，其中含量較高的是苯乙醛、吲哚、糠醛等。張榮[69-70]從醬香高溫大曲中分離鑒定出3株地衣芽孢桿菌，經GC-MS分析其發酵液中揮發性組分，結果表明，乙偶姻、四甲基吡嗪和呋喃扭爾是這3株菌的特征風味化合物，四甲基吡嗪是發酵后期由乙偶姻轉化而來的，且該物質含量在55℃時比低溫時明顯升高，此高溫下發酵液醬香風味也愈發明顯，將實驗菌株應用于實際生產中，發現地衣芽孢桿菌數量明顯增加，頭段酒樣中芳香族類和吡嗪化合物的含量有了顯著提高，且產出酒液風味較好。趙興秀等[71]從醬香高溫大曲中分離篩選出3株醬香風味明顯的菌株，經鑒定均為枯草芽孢桿菌，通過HS-SPME與GC-MS技術分析檢測，3株芽孢桿菌發酵產物中吡嗪類及酮類物質相對含量較高。羅建超等[72]從醬香高溫大曲中分離出芽孢桿菌104株，經鑒定為枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等，產醬香優良的有25株，能產二乙酰、乙偶姻等物質。以上研究表明，醬香酒釀造過程中常見細菌為枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等，所產物質有醛、醇、吡嗪、烷烴類物質等，不同的細菌所產物質有所差異。醬香白酒釀造工藝離不開豐富的細菌群落，以芽孢桿菌為主的細菌可作用于原料，生成可促進醬香風味形成的物質，為酒體的典型風格塑造提供物質保證。

3.2.2 真菌產香研究

真菌在釀酒工藝過程中也是重要的一類微生物，主要為酵母和霉菌，其在釀造工藝中除了具有糖化、酒化作用，還可以生成一定量的酯類、醛類、雜環類物質，同樣為醬香風格的形成提供物質基礎。蔡雪梅等[19]從醬香型白酒釀造酒糟中篩選出7株高產乙酸乙酯的酵母菌株，其產物涉及醇類、酯類、酸類、吡嗪類、酮類等多種物質，最后確定其中1株產醬香風味的酵母為畢赤酵母。路曉偉等[45]從醬香白酒釀造環境中篩選出1株釀酒酵母，其可以利用多種糖類發酵產乙醇，產物中以苯乙醇、法尼醇、橙花叔醇、乙偶姻和大馬酮的含量較高。凌杰[73]研究了地衣芽孢桿菌及釀酒酵母之間的相互關系，研究表明，地衣芽孢桿菌可促進釀酒酵母產2-甲基丁酸和4-乙烯基愈創木酚等風味物質，而4-乙烯基愈創木酚正是醬香風味中的關鍵組分。韓瑩等[74]從茅臺大曲中分離篩選出1株毛霉，GC-MS分析其發酵主要代謝產物為亞油酸乙酯和油酸乙酯，這兩種成分是茅臺酒空杯留香的主要成分。鄧皖玉等[75]從高溫大曲中分離篩選出3株霉菌，此3株霉菌均會產生少量的胺類物質，并且會產生乙硫醇、二甲基硫、二硫二甲基等硫化物，這些物質少量時可以促進醬香風味的形成，進一步轉化為含硫的雜環類物質。多數霉菌可以代謝產生色素，使得曲心、曲表等位置體現出不同的顏色，如黃曲霉可以產黃色素，黑曲霉可以產黑色素等[51]。以上研究表明，真菌不僅可以產生多種風味物質，其亦可以催化體系內的某些反應促使其他化合物的生成。在醬香白酒釀造過程龐雜的微生物區系中，細菌、酵母、霉菌之間存在著一定的相互促進、相互拮抗的作用，在高溫、高酒精度、低pH值的環境下不斷的馴化，最終也會使得一些真菌具有一定的耐受性，從而改變其代謝產物[58]。微生物代謝產物最終進入生化反應中進行復雜的物質轉化及能量轉換，從而完成整個釀造過程。

4 展望

“多微共酵”是醬香白酒釀造過程中的顯著特點。醬香白酒中的各香味成分含量通常為1/10萬～1/100萬,甚至是千萬分之幾,其余的是乙醇及水，香味即是靠這些含量極微的化合物而體現出來[77]。從大曲的制備到酒醅發酵的過程中，相關微生物區

系內部發生著復雜的協同代謝作用，將原料轉化為繁多的特殊化合物。因此對呈香物質的研究要從醬香工藝中的微生物代謝入手，重點是要了解其中的發酵機理及其相互之間的交叉作用，解析其中的微生態作用過程。后再進一步以基因工程手段融合或選育優良性狀菌株，將其運用于工業生產中，在提高醬香品質、促進原料轉化、提高出酒率方面進行重點研究，這不僅可為醬香酒生產中復雜的生化反應找到可靠的科學依據，對工藝的改進創新也具有重要意義。隨著現代生物技術的飛速發展，業內科研工作者可從微生物多樣性、分子生物學、生物信息學、蛋白質組學等方面逐步揭開醬香白酒釀造過程中微生物多樣性變化及其代謝產物的神秘面紗。