不同功能菌液人工窖泥的培養研究

張 健，張宿義，2，秦 輝，2，楊 艷，邱川峰，徐 瓊，康承霞，羅 杰，李德林，馬 蓉，王加彬

（1.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000； 2.國家固態釀造工程技術研究中心，四川瀘州646000）

濃香型白酒的生產以泥窖為主要容器和基礎，窖泥中棲息著豐富而極其復雜的微生物菌系，其中主要的有益功能菌如己酸菌、丁酸菌、甲烷菌、硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌等[1]。正是這些有益功能菌的大量生長、繁殖、代謝以及相互協調作用，才賦予了濃香型白酒的獨特香味，形成了以己酸乙酯為主體香的典型風格[2]。窖泥質量的優劣對濃香型白酒的質量起著至關重要的作用。為了提高窖泥培養質量，各大企業和專家學者對人工培養窖泥工作開展了大量研究，并總結形成了以優質的原始窖泥為基礎，通過添加營養物質、老窖泥及各類功能菌，營造良好的環境條件，使有益功能菌迅速生長繁殖成優勢菌群，從而培養出能夠達到老窖泥特性的人工窖泥[3]。人工窖泥培養過程中，添加的窖泥功能菌液主要有純種己酸菌培養液或復合功能菌液。本研究采用從100余年老窖泥中富集培養的復合功能菌液、分離純化的己酸菌液以及將二者按比例混合培養的復合菌液培養人工窖泥，根據窖泥培養過程的升溫、理化指標、微生物變化以及窖泥感官評價，對窖泥培養進行綜合評價及分析。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 主要材料

黃泥、窖皮泥、老窖泥、麩皮、豆粕、曲粉、磷酸氫二鉀、黃水、尾水、窖泥功能菌液、純種己酸菌液。

1.1.2 主要儀器

LRH.250生化培養箱（上海一恒科技有限公司），VD-850桌上式潔凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），DT1002電子天平（常熟市佳衡天平儀器有限公司），BST0001萬用電爐（泰州市貝斯特電熱電器有限公司），YXQ-LS-100A立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司醫療設備廠），UV-1600PC紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司），窖池數顯溫度計（濟南雪納斯儀表有限公司），Agilent7890B型氣相色譜儀（美國安捷倫公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 窖泥功能菌液培養

從連續使用100余年窖底四周及中心點分別取樣后混合均勻，經富集培養及多次擴培篩選出產己酸能力強、菌體生長旺盛且穩定的窖泥復合功能菌液F1、F3，接種到窖泥時己酸菌數為2.6×108個/mL。分離純化己酸菌液S2、S4，接種到窖泥時菌數為3×108個/mL。窖泥復合功能菌液與純種己酸菌液按1∶1的比例混合擴大培養菌液，接種到窖泥時菌數為2.9×108個/mL。

1.2.2 人工窖泥培養方案

（1）窖泥培養原料：黃泥、窖皮泥、老窖泥、麩皮、豆粕、曲粉、磷酸氫二鉀、黃水、尾水，按10%比例接入窖泥功能菌液，方案設計見表1。

（2）將地面清洗干凈，把黃泥均勻鋪在地面上（厚度20～30 cm），潑上一定量的黃水和尾水，然后按比例依次將麩皮、豆粕、曲粉、窖皮泥、老窖泥層層均勻鋪在黃泥上面，再根據需要潑上一定量的黃水和尾水，最后均勻灑上磷酸氫二鉀。

（3）使用耙梳和鐵鏟將原料和黃泥拌和均勻，窖泥功能菌液采用潑灑的方式，邊潑灑菌液邊用攪拌機拌和窖泥，并根據感官判斷添加尾水。

（4）待所有原輔料拌和均勻后且窖泥柔熟后，將窖泥收堆成長條狀（2 m×2 m×0.75 m），用鐵鏟拍光，蓋上窖皮，四周用黃泥壓封，采用丟糟覆蓋保溫使其在30～40℃的環境下密封發酵90 d以上。

1.2.3 數據采集方法

每天定時定點檢測溫度，每15 d取樣測定理化指標及微生物數量，窖泥培養結束，經專家鑒定其質量后應用于生產。

1.3 檢測方法

己酸菌計數方法：血球計數板法。

溫度測定：窖池數顯溫度計。

水分、pH值、氨態氮、有效磷測定：參照《白酒生產技術全書》窖泥分析[4]。

有效鉀測定：參照《土壤農化分析》土壤中鉀的測定[5]。

腐殖質測定：參照《森林土壤腐殖質組成的測定》[6]。

窖泥微生物計數方法：稀釋平板法。

2 結果與分析

2.1 窖泥培養過程升溫情況

窖泥培養過程升溫情況見圖1。

從圖1可以看出，各方案中人工窖泥在培養過程中溫度變化呈現先上升，中間維持較高溫度，后期緩慢下降的規律。培養前期，窖泥中營養物質充足，加之殘存的氧氣，微生物快速生長繁殖產生大量的熱量，導致窖泥溫度逐漸升高，在25 d左右達到頂溫，升溫幅度在10～16℃之間，在頂溫附近維持15 d左右，而后由于營養物質的消耗和代謝產物的積累，微生物的生長及代謝活動逐漸變緩，窖泥溫度開始緩慢下降。

表1 方案設計

對比各方案可以看出，方案5和方案6中混合培養菌液培養的窖泥升溫幅度和頂溫均高于其他方案，復合功能菌液與純種己酸菌液培養的窖泥升溫情況相近。

2.2 窖泥培養過程理化指標變化情況

2.2.1 窖泥培養過程水分含量變化

水是細胞的重要組成部分，菌體所需營養物必須呈水溶液狀態才能被吸收，各種微生物的生化活動與窖泥含水量也有密切關系，水分過少時，微生物生長、繁殖困難；水分過大時，窖泥過稀，搭窖困難，使用不便，人工窖泥必須濕潤柔熟。所以，窖泥含水一般控制在35%～45%。窖泥培養過程水分含量變化見圖2。

由圖2可知，6個方案中，各方案起始水分含量均不超過37%，培養過程中窖泥水分含量均呈現逐漸增加的趨勢。在窖泥培養前45 d，窖泥水分含量明顯增加，這是由于培養前期，營養物質豐富，微生物利用添加的有機質等進行生長繁殖代謝，將有機質分解成CO2、H2O、H2S、NH3等小分子物質；后期由于營養物質的消耗及溫度過高或過低等原因，微生物生長及代謝活動減緩，水分緩慢增加。對比各方案得出，窖泥培養過程水分隨著培養時間的延長而升高，增幅相差不大，培養90 d后水分含量均在40%左右。

2.2.2 窖泥培養過程pH值變化

pH值一方面影響微生物代謝過程中一些酶的活性，超出一定的范圍都會使微生物的生長受到限制；另一方面會引起微生物細胞膜內外電荷的變化，從而影響微生物對營養物質的吸收[7]。己酸菌最適生長初始pH值為7.0，在中性或中性偏酸的條件下菌體增殖較好。窖泥培養過程pH值變化見圖3。

圖1 窖泥培養過程溫度變化情況

圖2 窖泥培養過程水分含量變化情況

由圖3可知，各方案在窖泥培養前45 d，pH值呈下降趨勢，后期pH值略有上升，后下降。主要由于前期營養豐富，微生物進行各種生化反應產生多種有機酸。從整個培養過程看，pH值降低，但下降幅度不大，培養終點pH值均在5.1左右。各方案之間表現出，兩種混合培養菌液培養的窖泥pH值降低較多，純種己酸菌液培養的窖泥pH值降低最少，可能是混合培養，微生物間協同作用增強，提高了功能菌的產酸能力，從而使pH值下降更多。

2.2.3 窖泥培養過程氨態氮含量變化

氨態氮是窖泥功能菌生長、繁殖所需的主要氮源，除曲藥中本身含有一定量的氨態氮外，氨態氮是微生物分解有機質而形成的。在使用的窖泥配方中，微生物主要可以分解豆粕、麩皮、曲藥中的有機質而形成氨態氮。窖泥培養過程氨態氮含量變化見圖4。

如圖4所示，各方案窖泥中氨態氮含量總體表現為逐漸增加的趨勢，培養結束后氨態氮含量在140 mg/100 g干土左右，較劉淼等[8]的研究，氨態氮含量偏低。主要是由于本文窖泥配方中所添加的氮源，均是有機氮源，除菌種培養基中添加少量硫酸銨以外，未單獨添加無機氮源。適宜的菌種添加量能保證有機質的分解進而作為氮源，減少無機氮源的添加，能有效防止窖泥板結等現象，同時避免氨態氮積累過多，導致窖泥出現泥臭。

上周（8月13日-8月17日），市場供貨略偏緊，氯化鉀報價高位堅挺。8月20日中國氯化鉀批發價格指數（CKPI）為 2155.14點，環比上漲15.33點，漲幅為0.72%；同比上漲283.97點，漲幅為15.18%；比基期下跌1135.45點，跌幅為34.51%。

圖3 窖泥培養過程pH值變化情況

圖4 窖泥培養過程氨態氮含量變化情況

2.2.4 窖泥培養過程有效磷含量變化

有效磷是細胞核組成成分，也是微生物生長、繁殖的必需物質，因此，磷是窖泥功能菌增殖的必需物質。同時，磷又是參與乙醇、乙酸化合成己酸這一發酵過程的重要物質[9]。窖泥培養過程有效磷含量變化見圖5。

如圖5所示，各方案中有效磷均呈現出逐漸減少的趨勢，且在前15 d下降較多，后期有效磷含量上下波動、變化較小。在人工培泥過程中，不宜加過磷酸鈣和重過磷酸鈣，由于它們含有游離的酸性強的H3PO4、H2SO4，且Ca2+易與乳酸形成沉淀，造成窖泥板結退化，本實驗方案添加磷酸氫二鉀作為磷和鉀的補充。磷、鉀一般在窖內發酵中，從酒醅中得到補充，使含量越積越多，因此培養窖泥時滿足微生物生長即可，不必過量添加，否則會因無機鹽濃度過高而造成窖泥的板結，從而嚴重影響窖泥微生物的活動，致使窖泥退化。

2.2.5 窖泥培養過程有效鉀含量變化

窖泥培養過程有效鉀含量變化見圖6。

土壤中有效鉀主要為水溶性鉀和代換性鉀，它是酵母、霉菌、細菌等微生物所需的無機鹽類。雖然微生物對無機鹽需求量較少，但缺少鉀是不行的。如圖6所示，各方案中有效鉀含量在發酵過程中上下波動，總量基本維持不變。

2.2.6 窖泥培養過程腐殖質含量變化

窖泥中的腐殖質部分是在微生物酶的作用下形成的小分子化合物和微生物代謝產物的合成物，部分是由其他有機物腐殖化的過程形成[9]。它是窖泥水分和養料的貯存器，可以為窖泥微生物提供充足的水分和養分，具有保持窖泥營養，調節窖泥酸度，緩解乳酸鈣、乳酸鐵的生成，避免窖泥的板結退化等重要作用。使用時要防止因腐殖質過量而帶來的惡臭。窖泥培養過程腐殖質含量變化見圖7。如圖7所示，各方案中腐殖質均呈現出逐漸下降的趨勢，表明被窖泥微生物利用，但總體下降幅度不大；兩種混合培養菌液培養的窖泥腐殖質含量下降最少。

圖5 窖泥培養過程有效磷含量變化情況

圖6 窖泥培養過程有效鉀含量變化情況

圖7 窖泥培養過程腐殖質含量變化情況

2.3 窖泥培養過程微生物數量變化情況

2.3.1 窖泥中細菌總數變化

窖泥中細菌總數變化見圖8。

由圖8可知，窖泥培養前15 d，由于窖泥中添加的營養物質豐富，存在部分氧氣，且環境條件優越，方案1、方案3、方案5、方案6窖泥中細菌數量均有明顯增加；15～50 d，氧氣逐漸被消耗，窖泥溫度較高，細菌數量緩慢增加。后期由于營養物質大量被消耗，所以部分細菌開始死亡，有些細菌形成芽孢桿菌以適應環境變化，最終細菌數量達到平衡狀態。而方案2、方案4窖泥中細菌數量整體變化幅度不大，主要原因是兩種方案窖泥培養添加的菌液為經過分離純化的純種己酸菌液，雖然配方中添加老窖泥及窖皮泥中有其余窖泥功能菌存在，但數量較少。而其余方案中，所添加的復合窖泥功能菌液及混合培養菌液均較大程度地保留了窖泥中窖泥功能菌的多樣性，且部分菌種之間存在互利共生的關系，使其對環境有更強的適應能力。

2.3.2 窖泥中芽孢桿菌變化

在窖泥中，芽孢桿菌是濃香型白酒生產的主要釀酒功能微生物。芽孢桿菌對己酸的產生起到非常重要的作用，正是它們使濃香型白酒具有其獨特的風格和香味。窖泥中芽孢桿菌變化見圖9。

由圖9可以看出，6個方案中，窖泥培養發酵過程芽孢桿菌數量總體變化均呈先增加后減少的趨勢；在發酵進行到30 d時，方案1、方案3窖泥中芽孢桿菌數量超過其他幾種方案，達到最大值，隨后呈現逐漸減少的趨勢；而方案2、方案4、方案5、方案6窖泥均在發酵45 d時，芽孢桿菌數量達到最大值。此后，方案5、方案6窖泥中芽孢桿菌數量高于其他幾種方案。方案1、方案3芽孢桿菌數量峰值高于其他方案且達到峰值的時間更短。分析原因可能是，通過富集培養的復合功能菌液菌群更豐富，在菌群的協同作用下環境適應能力更強。

圖8 窖泥培養過程細菌總數變化情況

圖9 窖泥培養過程芽孢桿菌變化情況

2.3.3 窖泥中酵母菌數變化

窖泥中酵母菌數變化見圖10。

由圖10可看出，各方案在發酵前15 d，酵母菌數量均有所下降，在后期培養過程基本呈現出增加、減少交替出現的趨勢。總體來看，方案2、方案4窖泥中酵母菌數總體變化不大，其他方案窖泥中酵母菌數變化明顯，培養結束后，酵母菌數量明顯增加。

2.3.4 窖泥中霉菌總數變化

窖泥中霉菌總數變化見圖11。

由圖11可看出，方案2、方案4窖泥中霉菌數總體變化不大，其余4種方案窖泥在發酵前15 d，霉菌數量大幅下降，這同任道群等[10]研究的霉菌前期變化規律一致，培養75 d后有所增加。

在窖泥培養過程中，微生物總體呈現態勢為細菌總數＞芽孢桿菌＞霉菌＞酵母。通過對比可以大致得出，以富集培養的復合功能菌液和混合培養的菌液接種培養的窖泥中，細菌、芽孢桿菌、霉菌和酵母數量都高于純種己酸菌液，且混合培養的各種微生物數量又高于富集培養的復合菌液，主要是因為：富集培養液和混合培養菌液生物多樣性高，菌群更豐富，各種微生物間相互促進、互利共生；同時，純菌種繁殖代謝能力強，菌株強壯，畸形率低，能較穩定的保持生長優勢。

2.4 窖泥感官評價

由于各廠家窖泥培養過程中添加的窖泥功能菌液比例、各種配料的種類及比例不同，導致各理化及微生物指標差異較大，亦沒有相關標準對窖泥質量等級進行劃分，因此窖泥質量以感官鑒定為主。在窖泥90 d發酵結束后，對不同窖泥進行感官評價，結果見表2。

圖10 窖泥培養過程酵母菌變化情況

圖11 窖泥培養過程霉菌總數變化情況

表2 不同方案人工窖泥的感官鑒定

從各方案窖泥感官鑒定看來，方案2、方案4窖泥氣味比較單一、缺少窖香味，而各方案窖泥老熟程度差異不大。

3 總結

添加不同窖泥功能菌液培養人工窖泥，其發酵正常，升溫幅度及維持頂溫的時間相差不大；各方案理化指標變化規律趨于一致，數量上有一定差異：均表現出窖泥水分、氨態氮含量隨著發酵的進行逐漸增加，窖泥pH值、有效磷、腐殖質隨著發酵的進行逐漸減少，窖泥中有效鉀含量變化不大。各方案微生物數量呈現出細菌總數、芽孢桿菌先增加后減少；酵母菌及霉菌由于其數量較少，規律性不強。對比各方案微生物可以得出，添加復合功能菌液和混合培養菌液的4種窖泥培養方案，在各微生物數量上優于添加純種己酸菌液；且此4種方案的感官評價結果亦較優。后期，將6種方案培養的窖泥應用于同一班組不同窖池，在相同工藝參數的情況下，跟蹤幾排產酒情況，綜合評價窖泥質量。