草甘膦對(duì)黑斑蛙主要器官中抗氧化酶的影響

高愛保

(晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西晉中 030600)

草甘膦，化學(xué)名為N-(磷酸甲基)甘氨酸，不溶于有機(jī)溶劑，極性很強(qiáng)，易溶于水，它是一種非選擇性、無殘留、內(nèi)吸傳導(dǎo)型廣譜滅生性除草劑。雖然草甘膦對(duì)動(dòng)物的毒性很低，但由于其消耗量過大、施用范圍廣，還可能通過食物鏈富集，因此其毒性不可忽視。一方面，它們可直接進(jìn)入人和其他生物的體內(nèi)，引起急性、慢性中毒或畸變；另一方面，通過徑流、排污、揮發(fā)等途徑進(jìn)入土壤、水體和大氣，引起各種生態(tài)環(huán)境下生物的死亡，并通過食物鏈的富集、傳遞，影響人類的食品安全[1]。這些污染物進(jìn)入生物體內(nèi)，可形成多種中間產(chǎn)物，其中許多中間產(chǎn)物可進(jìn)入氧化還原循環(huán)，產(chǎn)生比母體污染物危害性更大的中間代謝產(chǎn)物，同時(shí)伴隨著大量的活性氧自由基的產(chǎn)生[2]。這些活性氧自由基若不及時(shí)清除，就會(huì)引起DNA斷裂、脂質(zhì)過氧化、酶失活等損傷[3]，對(duì)機(jī)體造成氧化脅迫。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)草甘膦的毒性研究已有不少報(bào)道。2007年，肖永紅等在草甘膦對(duì)中華大蟾蜍的慢性毒性的研究中發(fā)現(xiàn)，亞致死劑量的草甘膦溶液對(duì)中華大蟾蜍蝌蚪的生長(zhǎng)、發(fā)育和運(yùn)動(dòng)頻率有抑制作用[4]。2010年，張彬彬研究的草甘膦對(duì)鯽魚肝臟內(nèi)膜系統(tǒng)和超氧化物歧化酶的影響表明，隨草甘膦質(zhì)量濃度增加，干細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)中線粒體腫脹及空泡化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡化，不同質(zhì)量濃度的草甘膦處理對(duì)鯽魚肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)均起誘導(dǎo)作用，SOD活性隨污染物質(zhì)量濃度升高而升高，96 h處理SOD活性先被誘導(dǎo)，而后出現(xiàn)抑制效應(yīng)[5]。

黑斑蛙(Rananigromaculata)是無尾目、蛙科、蛙屬的兩棲動(dòng)物，成蛙常棲息于池溏、水溝邊等近水域附近的草叢中。近年來，兩棲類動(dòng)物在全球范圍內(nèi)出現(xiàn)了嚴(yán)重的種群衰退現(xiàn)象，尤其是農(nóng)藥和除草劑使用后的負(fù)面影響已引起人們的重視[6-7]。同時(shí)，草甘膦對(duì)環(huán)境及有益生物的影響受到關(guān)注[8-9]。兩棲類動(dòng)物是生態(tài)群落的重要組成部分，因此它們的消亡和滅絕將會(huì)對(duì)生物多樣性產(chǎn)生巨大的威脅。近年，隨著環(huán)境污染的日益加重，兩棲動(dòng)物種類在世界各地正在急劇地衰減或消失[10]。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者報(bào)道了常見殺蟲劑和除草劑對(duì)兩棲類的毒性及對(duì)兩棲類種群衰退的影響，他們對(duì)常見的兩棲類物種不明原因地衰減或消失進(jìn)行了多次論證，認(rèn)為兩棲動(dòng)物由于其皮膚的高滲透性、水陸兩棲等生物學(xué)特性，對(duì)環(huán)境污染極其敏感，兩棲動(dòng)物種群的變化與環(huán)境污染物有密切的關(guān)系[11-13]。本試驗(yàn)用不同濃度的草甘膦研究其在不同時(shí)間內(nèi)對(duì)黑斑蛙的肝臟、腎臟和皮膚中SOD活性及過氧化氫酶(CAT)活性的影響，了解草甘膦對(duì)其抗氧化系統(tǒng)的毒害，從而為合理使用草甘膦、保障生物多樣性和提高生物安全性提供初步的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

健康成年黑斑蛙平均體長(zhǎng)為(74.5±4.5) mm，隨機(jī)均分為對(duì)照組和染毒組，放在室內(nèi)盛有3～5 cm 不同體積分?jǐn)?shù)的草甘膦(41%草甘膦異丙胺鹽水劑，南京華洲藥業(yè)有限公司)溶液的小桶內(nèi)養(yǎng)殖，對(duì)照組溶液為飲用水，每天更換1/2溶液，且投喂1次。試驗(yàn)組分為5個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，其體積分?jǐn)?shù)梯度為0.82、1.23、1.64、2.05、2.87 mL/L；定時(shí)觀察記錄黑斑蛙外形及生理變化。

1.2 試驗(yàn)方法

每隔10 d以雙毀髓法處死，取其皮膚、肝臟和腎臟測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活力和過氧化氫酶(CAT)活性，并記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 草甘膦對(duì)黑斑蛙肝臟中SOD活性的影響

由圖1可知，不同體積分?jǐn)?shù)草甘膦處理后黑斑蛙肝臟中SOD活性發(fā)生變化，與對(duì)照組相比呈先增高后降低的趨勢(shì)。10 d時(shí)，對(duì)照組肝臟中SOD活性與0.82、1.23 mL/L組無顯著差異。SOD最高值33.35出現(xiàn)于2.87 mL/L組，其余體積分?jǐn)?shù)組與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。20、30 d對(duì)照組肝臟中SOD活性均與處理組有顯著差異(P<0.05)。30 d處理SOD活性升高后，為降低，草甘膦體積分?jǐn)?shù)為2.05 mL/L時(shí)，SOD活性出現(xiàn)最高值，為33.808 U/mg。

2.2 草甘膦對(duì)黑斑蛙腎臟中SOD活性的影響

由圖2可知，不同體積分?jǐn)?shù)草甘膦處理后，黑斑蛙腎臟中SOD活性變化。10 d時(shí)，腎臟SOD活性與對(duì)照相比，除最低體積分?jǐn)?shù)0.82 mL/L組外，其他組均差異顯著(P<0.05)。20、30 d時(shí)，所有處理組與對(duì)照組相比均有顯著差異(P<0.05)。SOD活性最大值33.29 U/mg出現(xiàn)于2.05 mL/L處理 20 d 時(shí)。

2.3 草甘膦對(duì)黑斑蛙皮膚中SOD活性的影響

由圖3可知，不同體積分?jǐn)?shù)草甘膦處理后，黑斑蛙皮膚中SOD活性變化。10 d時(shí)，腎臟SOD活性僅2.05 mL/L組與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)。在2.05 mL/L時(shí)，10、20 d所有處理與對(duì)照組均有顯著差異(P<0.05)。SOD活性最大值 38.708 U/mg 出現(xiàn)于2.05 mL/L處理10 d時(shí)。

2.4 草甘膦對(duì)黑斑蛙肝臟中CAT活性的影響

由圖4可知，不同體積分?jǐn)?shù)草甘膦處理后，黑斑蛙肝臟中CAT活性與對(duì)照組相比有先增高后降低的趨勢(shì)；肝臟中CAT活性與對(duì)照組相比均顯著升高(P<0.05)，但不同體積分?jǐn)?shù)草甘膦對(duì)CAT活性間差異不顯著。CAT最低值4.49 mg/(g·min)出現(xiàn)在 0.82 mL/L 處理10 d時(shí)，最高值4.52 mg/(g·min)出現(xiàn)在1.64 mL/L處理 30 d時(shí)。

2.5 草甘膦對(duì)黑斑蛙腎臟中CAT活性的影響

由圖5可知，經(jīng)過不同體積分?jǐn)?shù)草甘膦處理后，黑斑蛙腎臟中CAT活性與對(duì)照組相比較有升高的趨勢(shì)。處理10、20、30 d時(shí)，腎臟CAT活性與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)，表明草甘膦處理后CAT活性發(fā)生了顯著變化，從而對(duì)抗氧化損傷壓力。CAT活性最低值1.81 mg/(g·min)出現(xiàn)在0.82 mL/L處理 10 d 時(shí)，最高值2.22 mg/(g·min)出現(xiàn)在1.64 mL/L處理30 d時(shí)。

2.6 草甘膦對(duì)黑斑蛙皮膚中CAT活性時(shí)影響

由圖6可見，經(jīng)過不同體積分?jǐn)?shù)草甘膦處理后，黑斑蛙皮膚中CAT活性與對(duì)照組相比較有升高的趨勢(shì)，處理10、20、30 d時(shí)各體積分?jǐn)?shù)組皮膚CAT活性與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)，尤其是 2.87 mL/L 體積分?jǐn)?shù)處理組，與對(duì)照差異極顯著(P<0.01)，表明草甘膦處理后皮膚中CAT活性很快發(fā)生顯著變化，從而對(duì)抗氧化損傷壓力。處理組CAT活性最低值 6.098 mg/(g·min) 出現(xiàn)在 0.82 mL/L 處理10 d時(shí)，最高值 10.728 mg/(g·min) 出現(xiàn)在1.64 mL/L處理 30 d 時(shí)。

3 討論

近年來，除草劑草甘膦的使用所帶來的危害已經(jīng)引起越來越多的人的關(guān)注，而本身它作為一種潛在的生態(tài)危險(xiǎn)源，已經(jīng)被眾多研究者探究，兩棲類動(dòng)物種群的消失與農(nóng)藥的使用有一定的相關(guān)性。草甘膦對(duì)植物的毒性作用機(jī)理被認(rèn)為是低風(fēng)險(xiǎn)的除草劑，因此對(duì)它的使用得到了推廣，使用量也逐年增加。但農(nóng)藥的使用不可能全部被雜草吸收，隨著雨水的沖刷、液體的蒸發(fā)，使得部分草甘膦殘留在土壤、大氣以及水域系統(tǒng)中，這樣再加上時(shí)間的積累、食物鏈的富集，有可能同樣會(huì)威脅到人類的生存和健康。

在生物的抗氧化系統(tǒng)中，SOD和CAT均是重要的抗氧化劑。在草甘膦染毒后，組織中的SOD活性和CAT活性被誘導(dǎo)，不同體積分?jǐn)?shù)的草甘膦溶液隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng)，SOD活性和CAT活性總體呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì)，這與張彬彬研究的草甘膦對(duì)鯽魚肝臟內(nèi)膜系統(tǒng)和超氧化物歧化酶活性的影響的結(jié)果[5]相似，但在1.64～2.87 mL/L體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，0～20 d內(nèi)SOD活性和CAT活性均增強(qiáng)，而在20～30 d 內(nèi)其活性則在減弱，表現(xiàn)出劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)，即隨時(shí)間延長(zhǎng)，出現(xiàn)氧化損傷加大、毒害程度加深的現(xiàn)象，并且在不同組織器官中差異顯著，皮膚裸露在外，短時(shí)間就能作出反饋，而腎臟中反應(yīng)相對(duì)滯后，因而SOD、CAT活性具有組織特異性。從本試驗(yàn)的結(jié)果可知，除草劑草甘膦對(duì)黑斑蛙具有一定的危害性，草甘膦對(duì)成年黑斑蛙的安全使用體積分?jǐn)?shù)為1.64 mL/L。而農(nóng)業(yè)上除草時(shí)使用的濃度均高于這一濃度，會(huì)使超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性受到抑制。

由于除草劑具有選擇毒性，對(duì)天敵的致死率與殺蟲劑相比普遍較低，因此人們以往并不太關(guān)注除草劑對(duì)天敵動(dòng)物的影響，但實(shí)際上，農(nóng)業(yè)耕作過程中所施用的除草劑僅有少部分被植物吸收，大部分被噴施在與作物同一生境的動(dòng)物體表或殘留在土壤和水體中，對(duì)水體和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)造成污染[14-15]。盡管草甘膦在被噴施到水體環(huán)境中時(shí)濃度會(huì)被水體有所稀釋，但水面蒸發(fā)以及草甘膦積累可導(dǎo)致水環(huán)境中草甘膦濃度升高，即使按照草甘膦的常用濃度施用，也將會(huì)對(duì)黑斑蛙造成不同程度的危害。從本研究中黑斑蛙的生長(zhǎng)狀況來看，低體積分?jǐn)?shù)草甘膦的使用可提高它的活躍性和運(yùn)動(dòng)頻率；高體積分?jǐn)?shù)的草甘膦使得它的生長(zhǎng)緩慢、運(yùn)動(dòng)遲緩；但隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng)，不論草甘膦為低體積分?jǐn)?shù)還是高體積分?jǐn)?shù)，都會(huì)導(dǎo)致黑斑蛙生長(zhǎng)緩慢、運(yùn)動(dòng)遲緩。