豬胸膜肺炎放線桿菌ftsI基因的克隆及分析

郝知友，鄒玖零，禹小芳，屈蓓蓓，李英明，黃復深

（1.湖南省永州市畜牧水產局，永州 425000；2.湖南農業大學，長沙 410000）

0 引言

豬傳染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）是由豬胸膜肺炎放線桿菌感染引起的一種高度傳染性呼吸系統疾病。主要表現為急性出血性纖維素性胸膜肺炎和慢性纖維素性壞死性胸膜肺炎，該病發病快，常引起大批豬只死亡[1]。該病的防治主要采用抗生素和滅活苗進行，但由于豬胸膜肺炎放線桿菌血清型多，各地流行存在差異，滅活苗交叉保護效果離臨床要求較遠，因此多采用抗生素進行治療。抗生素的使用可能產生耐藥性，因此需尋找新的藥物靶點，篩選新的藥物[2-3]。研究細菌細胞分裂是篩選藥物新靶點的途徑之一[4-5]。

FtsI是在細菌分裂過程中一個重要的蛋白分子[6]，FtsI是原核細胞分裂時的主要細胞骨架蛋白，與微管蛋白同源，細胞分裂時可與其他的細胞分裂蛋白組裝成Z環，Z環的收縮促進細胞分裂。研究表明[7-10]：關于ftsI的報道主要見于植物葉綠體和人患疾病的研究，但是專門針對APP的FtsI基因及相應的編碼蛋白卻未見研究報道。目前研究最多的是FtsI，它廣泛存在于原核生物、真核生物，而且不同物種中ftsI基因在序列和結構上呈現高度的保守性[4，11-14]。細菌細胞分裂與FtsI蛋白水平密切相關，純化的ftsI蛋白是一種具有GTP酶活性的GTP結合蛋白[15]，而且GTP酶活性和ftsI蛋白的濃度密切相關。研究表明至少含有21個與App細胞分裂體相關蛋白質的基因參與了App的細胞分裂過程，其中ftsL參與分裂體成熟和穩定的肽聚糖（PG）結合蛋白基因[14]。本研究的目的是通過對App ftsI基因的分析，了解其在豬胸膜肺炎放線桿菌細胞分裂的意義，為下一步研究藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養基

豬胸膜肺炎放線桿菌血清型Ⅰ于本實驗室保存，胰蛋白大豆肉湯培養基（TSB）購自青島日水生物技術有限公司，無支原體超級新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，NAD氧化型輔酶Ⅰ購自北京鼎國生物技術有限公司。

1.2 主要試劑

PCR反應用試劑（2×Taq PCR Master Mix）、DNA標準分子量（D2 000 Maker）購自北京天根生化科技有限公司。

1.3 FtsI基因的擴增與鑒定

常規方法提取細菌基因組DNA。根據GenBank中已收錄的App基因組序列收錄的FtsI基因序列，采用軟件進行引物設計FtsI外引物一對。PF：5’-AAATCAGCACGAGGGAGATAAAA-3’，PR：5’-GTTTGCCCC TTATTCCTATCTTA-3'。FtsI基因的PCR擴增反應條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性50 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環，最后72 ℃延伸10 min。PCR產物經l%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確定后送上海生物工程公司測序。

1.4 ftsI序列

測序結果采用開放式閱讀框ORF在線分析軟件分析，跨膜區采用應用TMHMM軟件和SOPMA（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）軟件分析，將其相應的氨基酸序列進行結構和功能分析。應用在線blast軟件找出豬胸膜肺炎放線桿菌不同血清型的ftsI蛋白的相關序列，用臨接法（NJ）繪制出基因進化樹進行分析，同時采用Megalign軟件對不同血清型的所有蛋白質序列進行相似性分析。

2 結果

2.1 APP的ftsI目的基因PCR擴增結果

以豬胸膜肺炎放線桿菌血清型1的基因組為模板，對目的基因ftsI進行PCR擴增。將PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，可見一條2 000 bps左右的特異擴增產物帶，與目的基因基本一致，ftsI基因PCR擴增電泳圖見圖1。核苷酸序列在GenBank登錄，登錄序列號：KT253252。經ORF分析發現，該基因全長1 752 bp，含1個完整開放的閱讀框（ORF），由起始密碼子ATG至終止密子TAA，編碼584個氨基酸，編碼蛋白的理論分子量為42.6 kD，等電點為4.72。

2.2 ftsI基因序列

ftsI基因序列與GenBank中已報道的APP的血清1、3、5、7、8型相似度為96%～100%。系統進化樹可見，App的ftsI基因屬于進化的一個分支，與副嗜血桿菌有相近的親緣關系，而與大腸桿菌等的親緣關系較遠，ftsI的系統發育見圖 2。

圖1 ftsI基因PCR擴增電泳圖

圖2 ftsI的系統發育

2.3 ftsI蛋白質結構與功能

應用SOPMA軟件和TMHMM軟件分析發現，FtsI蛋白跨膜蛋白具1個跨膜區，跨膜區分析見圖3。二級結構預測具有α-螺旋區、β-折疊區、β-轉角區和無規卷曲4個結構類型，其中α-螺旋區占二級結構的66.90%，β-折疊占二級結構的60.00%，轉角占15.40%。分析三級結構，發現其具有2個模塊（Motif），App FtsI的三級結構見圖4。

圖3 跨膜區分析

3 討論與結論

研究表明豬胸膜肺炎放線桿菌呈短桿狀或球桿狀，菌體長短不一，菌體表層面有絨毛，其一端有一明顯的凹陷；細胞的分裂可發生在細胞中部或細胞的一極。至少含有21個與App細胞分裂體相關蛋白質的基因參與了App的細胞分裂過程，其中ftsL參與分裂體成熟和穩定的肽聚糖（PG）結合蛋白基因的過程[14]。

圖4 App FtsI的三級結構

研究從App基因組中擴增了App的FtsI 基因。研究表明該基因全長1 746 bp，含一個開放閱讀框（ORF），由起始密碼子ATG至終止密子TAA，編碼582個氨基酸。編碼蛋白的理論分子量為42.6 kD，等電點為4.72。與APP的血清1、3、4、5型相似度為96%～100%。系統進化分析表明，App的ftsI基因屬于進化的一個分支，與副嗜血桿菌有相近的親緣關系，而與大腸桿菌等的親緣關系較遠。蛋白質序列分析發現，ftsI蛋白在APP各血清型的同源性甚高，該蛋白可能成為App的廣普藥靶，且在其他病原菌也有一定的作用。

細菌細胞分裂涉及一類對熱敏感的基因，當外界環境的溫度升高時，這些基因的突變體表現出分裂活動的停滯，形成不分裂的長絲狀菌體，但在正常的生長溫度條件下，則進行正常的細胞分裂活動，這些對熱敏感的細胞分裂突變體統稱為fts突變體[8]。研究表明fts突變體涉及多個基因的參與，包括ftsL、ftsI、ftsW、ftsQ、ftsA、ftsZ、ftsJ、ftsH、ftsK、ftsB、ftsX、ftsY等，這些基因編碼的蛋白質參與細菌細胞分裂中的多個過程[4]。

研究以App血清1型基因組DNA為模板，PCR擴增出ftsL的目的基因片斷。FtsI廣泛存在于細菌中，是細胞分裂的一種重要功能蛋白。細菌細胞分裂時，單體FtsI蛋白聚集在一起組裝合成肌纖維，于分裂位點處形成Z-ring（Z環），與細菌細胞質膜內表面鑲嵌。Z環所在平面為分裂母細胞分裂部位[16]。FtsI的N端具有ATPase結構域，水解GTP，為質膜收縮供給動力，并順利分裂細胞[10]，FtsI與其他細胞分裂相關調節蛋白的共同作用，參與DNA的分離和細胞生長等重要生理過程[10，13]。同時，FtsI參與細菌細胞分裂時染色體的凝集[17]以及細胞壁的形成[16]。綠膿假單胞菌的研究表明，該基因的表達與細菌的耐藥性相關[18]，該研究為進一步研究App的 FtsI的功能及其在藥物篩選的意義奠定了基礎。