豬丹毒的病原學診斷及藥敏試驗

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(1.浙江省動物疫病預防控制中心，浙江 杭州 310018；2.寧波市奉化區畜牧獸醫總站)

寧波市奉化區某豬場生豬存欄720頭，其中母豬68頭。該場豬群于2018年5月開始發病，病初病豬食欲不振，病重的甚至食欲廢絕，精神沉郁, 被毛粗亂，體溫達到41.5 ℃以上，病豬糞便干硬呈顆粒狀，部分病豬的背部、頸部、臀部、耳根等處出現扁平微凸起的紫紅色疹塊,多為方形、菱形或不規則的圓形，指壓紅色可出現暫時消退；病豬呼吸急促呈腹式呼吸；也有少量病豬出現關節腫脹伴有跛行等臨床癥狀。對病死豬剖檢，主要病變表現為: 肺充血、水腫，胸腔有淡黃色積液，淋巴結腫大，呈紫紅色出血性炎癥，十二指腸及空腸前段發生出血性炎癥，脾臟充血腫大，呈淡紅色；腎臟淤血腫大，呈彌漫性暗紅色，縱切面皮質部有小紅點，心內外膜小點狀出血，關節腫脹，關節腔有多量漿液性纖維素性滲出液，滲出液為紅色粘稠性膠凍樣。發病由育肥豬開始，逐漸擴散至母豬、公豬和保育豬。病情前后持續了20多天，各類日齡豬只總共死亡150多頭。2018年6月，該豬場將2頭病豬肺臟送至浙江省動物疫病預防控制中心作進一步病原學診斷及藥敏試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 設備 培養箱購自Binder公司，型號：KB115；顯微鏡購自ZEISS公司，型號：Scope. A1；生物安全柜購自Thermo scientific公司，型號：1300 Series A2，細菌鑒定儀購自生物梅里埃，型號：VITEK 2 COMPACT，滅菌器購自TOMY公司，型號：SX-700。

1.1.2 培養基和試劑 血瓊脂平板購自鄭州安圖生物工程股份有限公司，革蘭氏染色液試劑盒購自青島高科技工業園海博生物科技有限公司，三糖鐵瓊脂及產硫化氫微量反應管購自青島高科技工業園海博生物科技有限公司，革蘭氏陽性菌鑒定卡購自生物梅里埃，藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.3 樣本來源 2018年6月11日，浙江省寧波市奉化區某豬場送檢的2頭病豬肺臟，分別編號為肺1、肺2。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離 無菌操作法切開病變組織，用接種環刮取病料接種于血平板，于37℃下培養24 h。

1.2.2 細菌鑒定

1.2.2.1 菌落形態 于血平板上培養18-24 h，觀察菌落形態。

1.2.2.2 細菌形態及染色特性 挑取可疑菌落作革蘭氏染色，油鏡下觀察細菌形態及染色情況。

1.2.2.3 過氧化氫酶試驗 在潔凈的載玻片上滴1滴3%的H2O2溶液，用接種環挑取適量的可疑菌在H2O2溶液中混勻，觀察是否有氣泡產生。

1.2.2.4 H2S觀察 挑取可疑菌落穿刺接種于三糖鐵斜面培養基，置37℃培養箱培養18-24 h，觀察結果。

1.2.2.5 生化鑒定 用無菌棉簽刮取適量細菌純培養物混懸于3 mL無菌生理鹽水中，使用VITEK 2濁度計測試細菌濃度，將細菌濃度調整至0.5～0.63麥氏單位，將GP細菌鑒定卡吸液導管置于菌懸液中，并置于細菌鑒定儀進行生化鑒定[3]。

1.2.3 藥敏試驗 按照NCCL推薦的K-B紙片瓊脂擴散法[4]，選用臨床上常用藥物分別對分離純化的菌株進行藥敏試驗。用無菌生理鹽水將待檢菌株制成0.5麥氏單位菌懸液，含菌量在5×107～5×108，用滅菌棉簽拭子浸入細菌懸液中，在管壁擠去多余菌液，然后均勻涂布在90 mm血平板上，室溫靜止3-5 min后，無菌操作將藥敏紙片均勻貼在上述血平板上，37℃培養48 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，判斷待檢菌株對各種藥物的敏感性。

2 結 果

2.1 細菌形態學檢查結果

2.1.1 菌落形態 肺1、肺2接種在血平板上培養24 h后，均出現細小、圓而凸起，有光澤，周圍有輕微的溶血菌落(圖1)。

圖1 肺1接種平板菌落生長情況

2.1.2 細菌形態 在肺1血平板培養物中，挑取可疑菌落(編號為ZJYK-01235菌株)涂片作革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陽性桿菌，菌體細長，菌體長短不一，平直或稍彎曲，有的呈長絲形，單獨存在，有的呈短鏈或V形排列[2](圖2)。

2.2 觸酶試驗結果 ZJYK-01235菌株觸酶試驗結果為陰性。

2.3 H2S產生情況 ZJYK-01235菌株在三糖鐵斜面培養基中均有黑色沉淀，表明有硫化氫產生(圖3)。

圖2 ZJYK-01235菌株鏡檢(1000×)情況

圖3 ZJYK-01235菌株H2S產生情況

2.4 生化鑒定結果 生化鑒定結果顯示ZJYK-01235菌株為紅斑丹毒絲菌，生化反應結果見表1。

表1 ZJYK-01235菌株兩株細菌生化鑒定結果

注：+ 表示為陽性，- 表示為陰性

2.5 藥敏試驗結果 ZJYK-01235菌株藥敏試驗結果表明，該菌株對阿莫西林、恩諾沙星等敏感，對慶大霉素、卡那霉素等耐藥(表2)。

表2 ZJYK-01235菌株藥敏試驗結果

注：S-敏感；I-中介；R-耐藥

3 討 論

丹毒絲菌屬包括紅斑丹毒絲菌(E.rhusiopathiae)、產單核細胞丹毒絲菌(E.monocytogenes)、扁桃體丹毒絲菌(E.tonsillarum)。豬源紅斑丹毒絲菌最早于1882年首次分離鑒定，是一種世界性廣泛分布的病原菌。紅斑丹毒絲菌引起的豬丹毒是一種急性、熱性、人畜共患傳染病，其特征主要表現為急性敗血癥和亞急性疹塊型，也有表現慢性多發性關節炎或心內膜炎[1]。丹毒絲菌可感染包括哺乳動物、禽和魚類等70多種動物，其中豬最為敏感。豬紅斑丹毒絲菌主要感染3-12月齡豬，一年四季均可發病，發病率一般為10%～15%，嚴重時死亡率可達50%。豬丹毒廣泛流行于世界各地，為我國主要的豬傳染病之一，對養豬業造成嚴重的經濟損失[2]。

病豬和帶菌豬是本病的傳染源。帶菌豬以及其他帶菌動物的分泌物、排泄物排出菌體污染飲水、飼料、土壤、籠舍等，經消化道傳染給易感豬。本病也可以通過損傷皮膚及蚊、蠅、虱等吸血昆蟲傳播。本病多發于夏秋季節，5-8月呈流行高峰期，尤其是氣候悶熱、暴雨之后較易流行，冬春寒冷季節發病則較少[5]。為防止天氣突變所帶來的應激反應，增強免疫，可在飲水中添加多維、黃芪多糖等抗應激、提高免疫力藥物[6]。對豬舍、用具應保持清潔，可采用 1%～2%的氫氧化鈉溶液對地面進行消毒，對豬舍也可用10%的石灰乳涂刷墻面等[7]，以減少環境中有害微生物的生長。

該場發病初期用強力霉素、氟本尼考拌料防治，由于病豬食欲不振甚至食欲廢絕, 病豬并未攝入藥物，每天都有豬只死亡，防治效果不佳；后改用青霉素或阿莫西林肌注，用阿莫西林拌料, 并將豬群中的病豬迅速隔離治療，同時每天加強對豬舍消毒，病情得到有效控制。病情控制后又用豬丹毒、豬瘟二聯弱毒疫苗對全場豬只進行免疫，20 d后回訪，豬群病情穩定，無新病例發生。