TRAIL協同五味子乙素對腦腫瘤干細胞生長的影響

王東東， 張 宇， 張玉影， 趙貴芳， 呂 鵬， 鐘 越， 于洪泉， 齊 玲

膠質瘤是最常見的原發性腦腫瘤，惡性程度極高。調查研究顯示：中國原發性腦腫瘤的發病率為22.52/10萬。其中，膠質瘤占29.78%。并且，隨著惡性腫瘤發病率的逐年攀升，惡性膠質瘤發病率的上升也最為明顯[1，2]。因此，如何有效的控制甚至治愈膠質瘤是亟待解決的難題。研究表明，腦腫瘤干細胞(brain tumor stem cells，BTSCs) 是腦腫瘤發生、復發及對放化療產生抵抗的根源[3，4]，其缺乏有效的藥物治療。膠質瘤細胞對腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的敏感性不同，而五味子乙素(Schisandrin B，SchB)可抑制膠質瘤細胞的增殖[5，6]，但兩者對BTSCs的作用不清，因此，有必要研究TRAIL和SchB對BTSCs增殖的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Sch B(中國藥品生物制品檢定所)；DMEM/F12培養液、神經培養基、B27添加劑和小牛血清(美國Gibco公司)；TRAIL、人堿性成纖維生長因子(bFGF)和人表皮生長因子(EGF)(英國PeproTech公司)；木瓜蛋白酶(Worthington DBA，Freehold，NJ)；CD133免疫磁珠(Miltenyi Biotec)，二甲基亞楓(DMSO)和四甲基偶氮唑(MTT)(美國Sigma公司)。

1.2 細胞培養 取新鮮人腦腫瘤組織(病理診斷為Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤)，將組織剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入木瓜蛋白酶置于37 ℃水浴中消化45 min，300 g，350 r/min，離心5 min，加入卵類黏蛋白液3 ml終止反應，反復吹打過濾，300 g，350 r/min，速度離心5 min，加入紅細胞去除液，搖床振蕩10 min。離心后細胞中加入無血清培養液洗滌細胞(神經培養基含有EGF 20 μg/L、bFGF 20 μg/L、B27添加物)，再次離心后將細胞重懸培養液中，臺盼藍計數活細胞，以2×106/75 cm2密度將細胞接種于培養瓶中，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養12 h。

1.3 CD133免疫磁珠篩選BTSCs 將上述培養的腫瘤細胞在次日吹打混勻后70 μm濾器過濾，計數活細胞。分選緩沖液洗滌，800 g，900 r/min速度離心3 min，將沉淀加入300 μl分選緩沖液混勻，再加入100 μl CD133免疫磁珠，混勻后4 ℃避光孵育30 min，再加入緩沖液洗滌，以800 g，900 r/min速度離心10 min，棄上清，再用緩沖液重懸細胞。先用500 μl緩沖液沖洗分選柱，將細胞懸液過柱，緩沖液洗分選柱3次，移柱出磁場，1 ml緩沖液洗柱，用泵加壓，收集洗液為CD133+細胞(即BTSCs)。

1.4 細胞增殖能力分析 機械分離BTSCs將其制成單細胞懸液，以5×103個/孔密度將其均勻接種于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養過夜。次日加入TRAIL(0、1、3、10、30和100 μg/ml)；Sch B (0、12.5、25、50和100 μg/ml)；TRAIL(0、1、3、10、30和100 μg/ml)聯合Sch B(100 μg/ml)，每個濃度設5個復孔，藥物作用24 h時，各孔再加入MTT 20 μl，繼續在培養箱中孵育4 h，棄上清，每孔加入DMSO150 μl，振蕩后在全自動酶標儀上測定各孔490 nm區的吸光度值，并依據公式計算細胞增殖能力=(A用藥組/A對照組)×100%。

2 結 果

2.1 TRAIL影響BTSCs增殖 不同濃度TRAIL作用于BTSCs 24 h時，均可以抑制細胞的生長增殖，尤其30 μg/ml和100 μg/ml組細胞的增殖能力明顯受到抑制，與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)(見表1)。

表1 TRAIL對BTSCs增殖能力的影響

與對照組比較：*P<0.01

2.2 Sch B影響BTSCs增殖 不同濃度Sch B作用于BTSCs 24 h時，均可以抑制細胞的生長增殖，尤其25 μg/ml、50 μg/ml和100 μg/ml組細胞的增殖能力均明顯受到抑制，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)(見表2)。

表2 Sch B對BTSCs增殖能力的影響

與對照組比較：*P<0.01

2.3 TRAIL聯合Sch B對BTSCs增殖的影響 不同濃度TRAIL聯合100 μg/mlSch B作用于BTSCs 24 h時，均可以明顯地抑制BTSCs 的生長增殖，與空白對照組比較，TRAIL濃度為30 μg/ml和100 μg/ml可抑制其增殖可達到50%以上，差異具有統計學意義(P<0.01)，見表3。

表3 TRAIL聯合Sch B對BTSCs增殖能力的影響

TRAIL濃度(μg/ml)細胞增殖率(%)對照組TRAIL組+SchB(100 μg/ml)組0131030100100.00±4.0887.67±7.3183.63±7.5081.75±4.6548.97±4.16?42.85±4.76?

與對照組比較*P<0.01

3 討 論

2008年美國國家綜合癌癥網(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)統計近30年美國癌癥，原發性惡性腦腫瘤發病率正呈逐年遞增，年增長率約為1.2%，老年人群尤為明顯。國內尚缺大規模流行病學調查。惡性膠質瘤確診后首選手術療法，術后結合放化療等綜合治療。很多學者對惡性膠質瘤的化療及放療等進行了大量研究，進展不明顯。近年，腫瘤生物學研究表明，腦腫瘤中存在一小群特殊的BTSCs，它們決定了腦腫瘤的發生、復發以及耐藥與否[5，6]。

TRAIL凋亡傳導途徑是人體內重要的、天然的抗腫瘤途徑，但大多數惡性膠質瘤細胞都存在TRAIL 抵抗現象[7，8]，甚至在初期用藥敏感后還會再出現繼發性耐藥。因此，TRAIL耐藥問題急需解決。膠質瘤發生耐藥是由于BTSCs的存在[3，4]。此前我們在研究中發現，長白山特色藥物五味子的主要成份Sch B可以抑制膠質瘤的體內外生長，并可以通過活化線粒體通路促進腫瘤細胞凋亡[9]。因此，TRAIL聯合Sch B可能解決TRAIL耐藥的問題。

我們原代培養了膠質瘤細胞后，應用CD133免疫磁珠分選法獲得BTSCs。應用MTT法檢測TRAIL、Sch B單獨及聯合作用對BTSCs增殖的影響發現：TRAIL和Sch B均可以濃度依賴性地抑制BTSCs的增殖作用，當兩者聯合作用時，可發生明顯的協同作用。尤其在高濃度TRAIL與Sch B共同作用BTSCs后，可以抑制BTSCs的增殖達50%以上。以上結果說明，Sch B有可能解決TRAIL耐藥問題，但其機制需進一步深入研究。