脂蛋白相關磷脂酶A2、頸動脈斑塊內新生血管與頸動脈粥樣硬化及缺血性腦卒中的相關性研究

田 曄， 賈 歡， 田 暉， 魏敬美， 于 萍， 郭 力， 李 彬

腦卒中尤其是缺血性腦卒中以其高發病率、高復發率、高死亡率及高致殘率成為全世界密切關注的衛生問題。在缺血性腦卒中諸多可能病因中，臨床最常見的即為大動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)，而頸動脈不穩定斑塊的脫落及破裂又是缺血性腦卒中發生的獨立危險因素[1，2]。研究表明，動脈粥樣硬化斑塊的形成及不穩性與內皮損傷、氧化應激、炎細胞的浸潤及新生血管生成等因素密切相關[3]。動脈粥樣硬化斑塊內的新生血管發育不成熟，通透性增高，加重脂質、炎性細胞等物質沉積，新生血管破裂還易引起斑塊內出血，加重斑塊的易損性。同時斑塊內增多的炎性物質可刺激巨噬細胞等產生基質蛋白酶等更多的炎性因子，進一步加重斑塊易損性和新生血管生成[4]。

近些年來超聲造影(Contrast-enhanced Ultrasonography，CEUS)技術發展突飛猛進，在檢測動脈粥樣硬化斑塊新生血管方面發揮著越來越大的作用。CEUS 技術具有較高的時間分辨率及空間分辨率，且造影劑微氣泡具有類似紅細胞的血流動力學特征，可作為血管內示蹤劑，CEUS 對活體頸動脈斑塊內新生血管的檢測具有很高的敏感性，而且具有半定量、定量評價的功能[5]。

研究顯示，炎性因子不僅在動脈粥樣硬化發生、發展及破裂的過程具有重要的作用，同時也可以刺激斑塊內新生血管的生成，加重斑塊的不穩定性，與急性腦血管事件發生密切相關[6]。近些年來，脂蛋白相關磷脂酶A2(Lipoprotein Associated Phospholipase A2，Lp-PLA2)在動脈粥樣硬化及其相關心腦血管疾病中引起廣泛關注。Lp-PLA2是一種非Ca2+依賴性的絲氨酸酯酶，屬于磷脂酶A2超家族中的成員。70%～80%的Lp-PLA2在血漿中通過載脂蛋白B(Apolipoprotein B，ApoB)與低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein Cholesterol，LDL)結合。Lp-PLA2在水解氧化型低密度脂蛋白(Oxidized Low Density Lipoprotein，ox-LDL)的過程中可以生成氧化型游離脂肪酸(Oxidized Free Fatty Acids，ox-FFA)和溶血卵磷脂(Lyso-phosphatidylcholine，lyso-PC)兩種較強的致炎物質，促進動脈粥樣硬化斑塊的形成，加重斑塊的不穩性[7]。

目前，國內外對于Lp-PLA2水平、頸動脈斑塊內新生血管與頸動脈粥樣硬化，尤其是與缺血性腦卒中的相關性仍存在一定爭議。本研究旨在探討Lp-PLA2水平與頸動脈粥樣硬化和缺血性腦卒中的相關性，并通過CEUS的方法研究頸動脈斑塊內新生血管等級與缺血性腦卒中及Lp-PLA2的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2016年12月～2017年12月于河北醫科大學第二醫院神經內科住院治療經頸動脈超聲檢測雙側頸動脈至少一處內膜中層厚度(IMT) >1.5 mm且為低回聲或不均質回聲斑的患者60例為病例組，其中男性34例，女性26例，平均年齡(60.27±8.11)歲，高血壓患者33例，糖尿病患者22例，吸煙者22例，飲酒者10例。收集同期在河北醫科大學第二醫院體檢中心體檢經頸動脈超聲檢測未發現動脈粥樣硬化斑塊的健康體檢者60例為對照組，其中男性32例，女性28例，平均年齡(58.33±7.60)歲，高血壓患者19例，糖尿病患者2例，吸煙者14例，飲酒者9例。排除標準：(1)除急性前循環腦梗死且同側頸動脈存在低回聲或不均質回聲斑塊外的其他類型腦梗死；腦出血、腦血管畸形等顱腦疾病。(2)各種嚴重先天性心臟病、各種嚴重冠心病、各種嚴重心律失常；嚴重的肺部疾病(慢性阻塞性肺疾病、彌漫性肺間質疾病，重癥肺炎)，各種原因引起的呼吸衰竭；(3)合并有嚴重肝腎功能損害者(肝酶和肌酐超出正常值3倍以上者)；(4)合并各種急慢性感染性疾病患者；(5)原發性血脂蛋白異常及繼發性脂蛋白代謝異常(未控制的糖尿病、甲狀腺功能減退癥、腎病綜合征、肝內外膽管阻塞及其他肝病、胰腺炎、異常球蛋白血癥、乙醇中毒；(6)意識障礙、卒中所致感覺性失語或嚴重肢體癱瘓而不能完成檢查、其他對診查不依從者；(7)妊娠期、哺乳期及準備妊娠的婦女；(8)有造影劑過敏者及嚴重的過敏體質者；(9)患者近期酗酒或藥物濫用史；(10)正在參加其他臨床試驗的患者或3 m內參加過臨床試驗者；(11)合并多系統嚴重疾病、多器官功能不全及自身免疫性疾病者等；(12)無法靜脈給藥的患者；(13)拒絕簽署知情同意書者；(14)精神類疾病患者及正在或曾經服用抗精神病藥物者；(15)各種外傷患者。所有入選患者及健康體檢者均由其本人或監護者簽署知情同意書，并提供血樣，過程符合醫學倫理及人道主義要求。

1.2 方法

1.2.1 血液指標測定 住院患者于入院次日晨抽取空腹靜脈血標本，健康對照者于體檢當日抽取空腹靜脈血標本，所得標本一部分進行血常規、生化全項及凝血常規檢查，另一部分放入促凝管內，充分混合均勻，于標本采集30 min內在2～8 ℃環境下以3000 r/min離心15 min，留取血清，-80 ℃ 保存備用。血清Lp-PLA2采用南京諾爾曼生物技術有限公司的NORMAN 系列散射比濁分析儀及Lp-PLA2測定試劑盒進行檢測，嚴格按照說明說進行操作。

1.2.2 頸動脈超聲造影檢查 對所有病例組患者進行頸動脈超聲造影檢查，采用型號為GE Logiq E9型的彩色多普勒超聲診斷儀，探頭采用ML6-15型探頭，探頭頻率為6～15 MHz，造影時機械指數調節為0.05～0.08，焦點設置為2～3 cm，增益設定為95%。采用意大利 Bracco公司的第二代超聲造影劑聲諾維(SonoVue)，主要活性成分為六氟化硫(sF6)。首先應用常規二維超聲縱向橫向分別檢查雙側頸動脈的斑塊位置、大小、形態及其回聲特點，非腦梗死患者選取斑塊厚度>1.5 mm的體積最大的斑塊為研究對象，急性前循環腦梗死者選取病灶對應側最大斑塊為研究對象，雙側梗死者選取斑塊大者，記錄斑塊位置、大小、形態及回聲特點。切換到超聲造影模式前選取好最合適位置，應用團注法將造影劑混懸液經留置針進行快速注射，注射0.9 ml后立即推注0.9%氯化鈉溶液5 ml，同時啟動計時器并進行圖像視頻采集，保持探頭固定，記錄觀察1.5 min左右。依據國內外相關文獻對斑塊的穩定程度設定分級標準[8]。分為4個等級：斑塊內無增強的新生血管信號為Ⅰ級；斑塊內部或周邊數個點狀增強的新生血管信號為Ⅱ級；斑塊周邊和內部散在點狀及線樣增強的新生血管信號為Ⅲ級；斑塊內部和周邊彌漫點狀及線樣增強的新生血管信號為Ⅳ級(見圖1)。

1.2.3 頭部核磁共振檢查(Magnetic Resonance Imaging，MRI) 對病例組患者行頭部核磁共振檢查，設備采用型號為GESigna3.0T超導型的核磁共振掃描儀，所得到的影像學圖像經至少2名影像科專業神經組診斷醫師閱片，當出現意見不同情況時，醫師間協商討論后得出一致結論。根據頭部核磁檢查結果，將病例組患者分為腦梗死組和非腦梗死組。

2 結 果

2.1 病例組與對照組比較

2.1.1 基礎臨床資料比較 本研究共納入符合入組標準的頸動脈粥樣硬化患者60例，體檢中心健康體檢者60例，兩組在性別、年齡、吸煙、飲酒方面差異無統計學意義(P>0.05)，在高血壓、糖尿病方面差異有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

2.1.2 血液學指標比較 病例組的Lp-PLA2，LDL明顯高于對照組，高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein Cholesterol，HDL)低于對照組，三項指標差異均有統計學意義(P<0.05)，兩組Lp-PLA2，LDL，HDL水平分別為(257.23±131.99)ng/ml、(171.55±80.91)ng/ml；(3.13±0.73)mmol/L、(2.85±0.71)mmol/L和(1.09±0.24)mmol/L、(1.37±0.28)mmol/L(見表2)。

2.2 腦梗死組與非腦梗死組比較

2.2.1 頸動脈斑塊內新生血管等級比較 將病例組60例患者根據頭顱核磁共振檢查是否存在梗死灶分為腦梗死組和非腦梗死組，其中腦梗死組40例，非腦梗死組20例，均行頸動脈超聲造影檢查，并對兩組頸動脈斑塊內新生血管等級進行比較。其中腦梗死組Ⅰ級1例(2.5%)、Ⅱ級10例(25.0%)、Ⅲ級18例(45.0%)、Ⅳ級11例(27.5%)，中位等級為Ⅲ級；非腦梗死組Ⅰ級4例(20.0%)、Ⅱ級9例(45.0%)、Ⅲ級3例(15.0%)、Ⅳ級4例(20.0%)，中位等級為Ⅱ級。兩組頸動脈斑塊內新生血管等級差異有統計學意義(P<0.05)(見表3)。

2.2.2 血液學指標比較 腦梗死組與非腦梗死組Lp-PLA2，LDL，HDL水平分別為(266.40±123.52)ng/ml、(238.90±149.18)ng/ml；(3.21±0.75)mmol/L、(2.98±0.66)mmol/L和(1.09±0.21)mmol/L、(1.10±0.29)mmol/L。統計結果顯示，兩組在Lp-PLA2，LDL，HDL水平方面差異無統計學意義(P>0.05)(見表4)。

2.3 不同頸動脈斑塊內新生血管等級的Lp-PLA2比較 病例組60例患者根據頸動脈超聲造影斑塊內新生血管等級分為4組，其中Ⅰ級5例、Ⅱ級19例、Ⅲ級21例、Ⅳ級15例。各等級Lp-PLA2水平分別為(186.80±108.27)ng/ml、(255.68±112.67)ng/ml、(271.66±119.87)ng/ml、(262.46±176.38)ng/ml。統計結果顯示，Lp-PLA2與頸動脈斑塊內新生血管等級比較差異無統計學意義(P>0.05)(見表5)。

2.4 Lp-PLA2與頸動脈粥樣硬化斑塊形成的相關性 對病例組及對照組患者以是否存在頸動脈粥樣硬化斑塊為自變量，以血清Lp-PLA2水平為因變量進行單因素分析，結果示Lp-PLA2水平與頸動脈粥樣硬化斑塊形成相關 (OR=1.007，95%CI1.004～1.011)，將高血壓、糖尿病、腦梗死加入進行調整，通過多因素分析顯示Lp-PLA2水平與頸動脈粥樣硬化斑塊形成仍具有相關性(OR=1.005，95%CI1.000～1.010)，將高血壓、糖尿病、腦梗死、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白加入進行調整，多因素分析結果顯示，Lp-PLA2水平不再是頸動脈斑塊形成的獨立危險因素 (OR=1.004，95%CI0.999～1.010) (見表6)。

2.5 頸動脈斑塊內新生血管等級與腦梗死的相關性 對病例組的患者以是否發生腦梗死為自變量，以頸動脈斑塊內新生血管等級為因變量，采用Logistic回歸分析，結果顯示，新生血管Ⅲ級與頸動脈粥樣硬化患者發生腦梗死密切相關(OR=24，95%CI1.952～295.061)，其他3個等級未發現明顯相關性(見表7)。

表1 病例組與對照組基礎臨床資料的比較[n(%)]

P<0.05 表示兩組間差異有統計學意義

表2 病例組與對照組血液學指標的比較

P<0.05 表示兩組間差異有統計學意義

表3 腦梗死組與非腦梗死組頸動脈斑塊內新生血管等級比較[n(%)]

P<0.05表示兩組間差異有統計學意義

表4 腦梗死組與非腦梗死組血液學指標比較[n(%)]

P>0.05表示兩組間差異無統計學意義

表5 不同頸動脈斑塊內新生血管等級的Lp-PLA2比較

P>0.05表示兩組間差異無統計學意義

表6 Lp-PLA2與頸動脈粥樣硬化的相關性

模型1：調整高血壓、糖尿病、腦梗死；模型2：調整高血壓、糖尿病、腦梗死、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白

表7 頸動脈斑塊內新生血管等級與腦梗死的相關性

圖1 頸動脈斑塊內新生血管等級：A 新生血管I級；B 新生血管Ⅱ級；C 新生血管III級；D 新生血管ⅳ級

3 討 論

動脈粥樣硬化是缺血性腦血管病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等威脅人類健康常見的缺血性心腦血管疾病的最主要病理基礎。大量研究證明，動脈粥樣硬化是一種血管壁的慢性炎性反應疾病，其發生和發展與炎細胞的浸潤及炎性因子的參與密切相關[9]。Lp-PLA2屬于磷脂酶A2超家族中的一員，又被稱為血小板活化因子乙酰水解酶(Platelet Activating Factor-acetylhydrolase，PAF-AH)，它是一種非Ca2+依賴性的絲氨酸酯酶，由441個氨基酸組成，相對分子質量為45KD[10]。血漿中絕大多數的Lp-PLA2通過載脂蛋白B與低密度脂蛋白結合，少量通過其他載脂蛋白與高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、脂蛋白a等結合[11]。Lp-PLA2水解ox-LDL可生成ox-FFA和lyso-PC，這兩種較強的致炎物質通過氧化應激反應損傷內皮細胞，誘導黏附因子表達，促進巨噬細胞吞噬ox-LDL成為泡沫細胞，同時刺激血管平滑肌細胞增殖，促進動脈粥樣硬化斑塊形成，還能引起多種炎性因子釋放，刺激斑塊內產生更多的Lp-PLA2，使斑塊不穩定性明顯增加[12]。Mannheim等[13]研究發現，對癥狀性頸動脈狹窄患者行頸動脈內膜剝脫術，病理檢查顯示斑塊內Lp-PLA2及lyso-PC水平均增高，并且呈一定的正相關性。Yang等[14]對前循環腦梗死患者的頸動脈斑塊進行多普勒超聲評估發現，混合斑塊組和穩定斑塊組Lp-PLA水平顯著低于不穩定斑塊組，多因素分析顯示Lp-PLA2水平是頸動脈斑塊形成及其易損性的獨立危險因素之一。

本研究通過對60例頸動脈存在不穩定斑塊的動脈粥樣硬化患者和60例無頸動脈斑塊的健康對照者進行比較發現，兩組之間在高血壓、糖尿病方面存在統計學差異，兩組血液中Lp-PLA2、LDL、HDL水平均有顯著的統計學差異(P<0.05)。Logistic回歸分析顯示，Lp-PLA2是頸動脈粥樣硬化的危險因素(OR=1.007，95%CI1.004～1.011)，校正高血壓、糖尿病后并未改變Lp-PLA2與頸動脈粥樣硬化的相關性(OR=1.005，95%CI1.000～1.010)，進一步校正LDL與HDL后Lp-PLA2與頸動脈粥樣硬化的相關性降低(OR=1.004，95%CI0.999～1.010)，不再是其獨立的危險因素。此結果也表明，Lp-PLA2在促進動脈粥樣硬化形成的過程中與LDL、HDL等脂類存在一定的相關性。

目前研究多認為動脈粥樣硬化是缺血性腦卒中的主要病理基礎，而炎性因子在動脈粥樣硬化斑塊形成、發展、破裂中起著不可忽視的作用[15]，越來越多的研究關注到動脈粥樣硬化相關炎性因子與缺血性腦血管事件之間的關系，Lp-PLA2被認為是心血管事件的獨立危險因素，并得到了廣泛的證實，但Lp-PLA2與缺血性腦血管病的相關性仍存在一定的爭議[16]。本研究中，60例頸動脈粥樣硬化患者根據頭部核磁共振是否存在腦梗死病灶分為腦梗死組和非腦梗死組，統計發現，兩組間在Lp-PLA2水平方面并無統計學差異(P>0.05)。本研究并未發現Lp-PLA2與腦梗死之間的相關性，可能與樣本量小有關，同時本研究中腦梗死組與非腦梗死組患者均為頸動脈存在不穩定斑塊者，且為橫斷面研究，而Lp-PLA2又與動脈粥樣硬化斑塊的不穩定性密切相關，故兩組之間的差異性會因此而削弱，非腦梗死組患者隨著時間推移可能會發生缺血性心腦血管事件。另外，Lp-PLA2有兩種常用的檢測方法，一種是含量檢測，一種是活動度檢測，研究發現含量檢測易受LDL、HDL等脂類物質影響，而活動度檢測可能相對更穩定，但兩者在預測疾病方面并不能完全相互替代[17]。本研究僅應用了含量一種檢測方法，結果尚缺少全面性。但是，曼哈頓研究在2014年公布的結果顯示，對1946例受試者平均隨訪11 y，最終151例發生缺血性腦卒中，校正相關危險因素后Lp-PLA2含量和活動度水平與缺血性腦卒中無顯著相關性[18]。Tai等[19]研究也發現Lp-PLA2含量和活動度水平與急性缺血性腦血管事件無明顯的相關性。因此，有關Lp-PLA2水平與缺血性腦卒中的相關性及其預測價值仍需要更多高水平的研究進一步探究。

動脈粥樣硬化斑塊的易損性與脂質核心增大、纖維帽變薄、炎性細胞浸潤以及斑塊內新生血管形成關系密切[3，20]。斑塊內新生血管是動脈粥樣斑塊不穩定性的重要原因之一，易誘發斑塊內出血、刺激炎性因子生成，導致斑塊破裂，繼發性血栓形成、栓子脫落導致心腦血管事件發生[21，22]。近些年來，CEUS技術的發展使得實時、定量觀測頸動脈斑塊內新生血管得以實現，研究發現CEUS顯示的斑塊內新生血管密度及斑塊的增強程度與斑塊的回聲有關，新生血管密度、增強程度越高，斑塊高危性越大，并且CEUS的結果與組織學檢測結果相一致[23]。研究發現，斑塊內新生血管密度及增強強度與癥狀性頸動脈粥樣硬化患者斑塊的不穩定性以及發生動脈粥樣硬化相關心腦血管事件密切相關[24，25]。本研究的結果一定程度上與上述研究相一致，通過對腦梗死組與非腦梗死組患者行頸動脈超聲造影發現，兩組間在新生血管等級方面有顯著的統計學差異(P<0.05)，腦梗死組的新生血管等級以III級為主，非腦梗死組以II級為主，其III、IV級新生血管比例明顯高于非腦梗死組。這也說明，高等級新生血管與頸動脈斑塊不穩定性及腦梗死的發生存在一定的相關性。通過Logistic回歸分析發現，新生血管III級與頸動脈粥樣硬化患者發生腦梗死密切相關(OR=24，95%CI1.952-295.061)。Huang等[26]對存在頸動脈軟斑的缺血性腦卒中患者和非缺血性腦卒中患者行CEUS檢查，同樣發現，斑塊內新生血管的等級越高，缺血性腦卒中發生的風險越大，但兩組在造影劑峰強度和達峰時間方面并無顯著統計學差異。

動脈粥樣硬化斑塊內新生血管結構不成熟，內皮細胞發育異常及內皮間連接不完整，導致其通透性增強，各類物質易在斑塊內沉積和易發生滲漏，也可引起斑塊內炎性反應以及血管反應，刺激巨噬細胞分泌更多的炎性因子，加重斑塊的不穩定性[4，27]。在本研究中，將60例頸動脈粥樣硬化患者根據CEUS檢查中新生血管等級分為4組，探究Lp-PLA2水平與斑塊內新生血管等級之間的相關性，經統計分析并未發現兩者之間差異有統計學意義(P>0.05)。盡管國內一些小樣本量研究顯示Lp-PLA2與斑塊內新生血管等級存在相關性，但尚缺乏大規模、高質量研究證實。Kolodgie等[28]通過尸檢發現，因冠狀動脈相關事件猝死的患者，其動脈粥樣硬化斑塊內Lp-PLA2的含量隨著斑塊的發生、發展逐漸增高，高濃度的Lp-PLA2多分布在壞死核心、易損破裂斑塊等部位。Dallit等[13]也通過免疫組化等方法發現，Lp-PLA2主要分布在壞死的脂質核心區。另外，研究發現，斑塊內新生血管多起自動脈外膜，由動脈外膜向斑塊內生長，可進入斑塊中心、斑塊肩部及內膜[29]，Saito等[25]通過頸動脈內膜剝脫術發現，斑塊內新生血管在斑塊肩部更多見。我們推斷，Lp-PLA2水平升高和斑塊內新生血管等級增高都能夠一定程度上影響動脈粥樣硬化斑塊的穩定性，但其在斑塊內的主要分布部位及作用機制存在一定的差異，因此兩者之間并無明顯的相關性。本研究尚存在一些不足之處，首先本研究樣本量較小，在混在因素較多的情況下可能一定程度上影響研究結果，需要更大樣本量，更高質量的研究來進一步驗證。其次，本研究僅檢測了Lp-PLA2的含量，并未進行活動度檢測與分析，結果尚不夠全面。另外，目前國際上對超聲造影的新生血管分級尚無統一標準，并且超聲檢查均具有一定的主觀性，為了減小主觀因素影響，本研究均由同一組超聲科專家全程進行操作。此外，由于技術條件限制，本研究僅采用二維超聲在單一平面對斑塊內新生血管進行評估，結果存在一定的誤差，而三維立體超聲評價斑塊內新生血管相對更加全面。

綜上所述，Lp-PLA2水平與頸動脈粥樣硬化不穩定斑塊形成具有一定的相關性，是頸動脈粥樣硬化的危險因素，并在一定程度上受LDL、HDL等因素的影響。Lp-PLA2水平與缺血性腦卒中無明顯的相關性，尚需更多研究進一步證實。頸動脈斑塊內新生血管等級與缺血性腦卒中的發生相關，新生血管等級高者(Ⅲ、Ⅳ級)，更易發生缺血性腦卒中，但尚未發現新生血管等級與Lp-PLA2水平之間的相關性，需要更多大樣本量、高質量的研究來共同探討。