MDBK細胞懸浮培養馴化方法及懸浮細胞系的建立

一、材料與方法

1.材料。MDBK細胞，金宇保靈獸用疫苗國家工程實驗室保存。DMEM培養基、胰酶、低血清培養基，均購自賽默飛世爾科技有限公司。無血清懸浮培養基購自上海奧浦邁生物科技有限公司。

2.方法。

（1）低血清培養馴化：取正常生長的貼壁MDBK細胞，在培養基中添加部分低血清培養基，當細胞適應生長后逐漸加大低血清培養基添加量，直至全部更換為低血清培養。待細胞完全適應低血清培養后冷凍保存，備用；

（2）低血清懸浮培養馴化：取已適應低血清培養的貼壁MDBK細胞，用胰酶消化后，按照5×105cells/ml加入三角搖瓶中進行懸浮培養，培養條件為：37℃，110 rpm，5%二氧化碳。待細胞適應懸浮培養后，冷凍保存，備用；

（3）無血清懸浮培養馴化：取已適應低血清懸浮培養的MDBK懸浮細胞，在低血清培養基中添加部分無血清培養基，當細胞適應生長后逐漸加大血清培養基添加量，直至全部更換為無血清培養。

二、結果與分析

在馴化過程中出現了細胞活力低、細胞死亡、生長緩慢、細胞聚團等一系列問題，通過以下方法得以解決：

MDBK-S懸浮細胞

1.細胞活力低、死亡問題，通過持續添加待馴化細胞提高細胞密度或更換部分培養基得以改善。

2.細胞生長緩慢問題，通過篩選適宜的培養基，及時補充葡萄糖及谷氨酰胺，調整轉速來解決。

3.細胞聚團問，通過消化分散添加葡聚糖或細胞沉降、篩網過濾獲取單個細胞。通過上述方法持續改進，最終獲得分散良好的MDBK細胞株。該懸浮細胞命名為MDBK-S，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.11795。細胞呈圓形，直徑14～25 μm，細胞分散均勻，可在不依賴附著物的情況下純懸浮培養，通過溶液優化與篩選細胞密度可達107cells/ml以上，細胞平均倍增時間35 h左右。

三、討論

通過初步試驗，該細胞可用于牛病毒性腹瀉/粘膜病、牛傳染性鼻氣管炎、牛呼吸道合胞體、牛副流感3型等病毒的培養，單位體積病毒產量可提高5～10倍，應用前景廣闊。

懸浮培養相比貼壁培養的優勢在于，可利用反應器大量培養細胞，生產放大工藝簡單，批間差較小，勞動強度小，占地空間少，生產效率提升明顯。

參考文獻（略）