急性腦梗死患者血清循環miR-424表達變化及其與炎癥反應、脂代謝的關系

郜樂樂，常永超，程麗妞，申緋翡，劉洪利

(1洛陽職業技術學院醫學系，河南洛陽471000；2河南科技大學第一附屬醫院；3洛陽職業技術學院藥學與檢驗系)

急性腦梗死(ACI)約占腦梗死的70%。早期診斷、及時采取有效的治療策略是影響ACI患者預后的關鍵[1]。原位血栓或其他部位血栓脫落導致腦栓塞是誘發ACI的主要原因。炎癥反應、脂代謝在ACI的發生、發展中起重要作用[2, 3]。白細胞介素6(IL-6)、IL-8、C反應蛋白(CRP)是臨床常用的炎癥因子指標。尋找能夠反映ACI病理改變的血清生物靶標，對于ACI的早期診斷、指導治療和預后判斷，均具有積極意義。微小RNA(microRNAs)是小非編碼RNA，長度18～25 nt，參與調節多種生理病理過程。ACI患者血清中存在多種異常表達的microRNAs[4, 5]。microRNA-424(miR-424)對ACI導致的腦組織缺血性損傷具有保護作用[6]。但目前關于血清循環miR-424在ACI早期診斷、預后判斷中的作用相關報道罕見。我們檢測了100例ACI患者血清循環miR-424，分析其與炎癥反應、脂代謝及患者預后的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年1月至～2017年3月間河南科技大學第一附屬醫院收治的100例ACI患者其中男62例、女38例，年齡59～78(68.21±6.35)歲，根據世界衛生組織(WHO)規定的ACI相關診斷標準[7]，制定納入標準：初次發作的腦梗死患者；發病72 h內入院；影像學檢查確診為ACI。排除標準：合并乙肝等傳染性疾病者；合并肝腎等重要器官功能不全者；具有心肌梗死、周圍血管性病變等病史者。100例患者根據NIHSS評分分為重度ACI患者61例和輕度ACI患者39例。選取同期我院門診體檢的60例健康者，其中男38例、女性22例，年齡60～78(67.58±6.66)歲。所有納入者年齡、性別比例等一般資料具有可比性。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究獲河南科技大學第一附屬醫院倫理委員會審核同意。

1.2 血清循環miR-424檢測 抽取納入者晨起空腹靜脈血10 mL，室溫靜置10 min，3 000 rpm離心20 min，取上清，-80 ℃保存備用。實時定量PCR法檢測血清循環miR-424：TRIzol試劑提取血清總RNA，采用Hairpin-itTM miRNAs qPCR定量試劑盒，ABI7500實時定量PCR系統，進行反應。反應條件如下，95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s，共40個循環。引物序列如下，miR-424正向引物：5′-GGCTAGTCAGCAGCAATTCATGT-3′，miR-424反向引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6反向引物：5′-AACGCTTCA CGAATTTGCGT-3′，以U6為內參，以2-ΔΔCt代表血清循環miR-424的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 血清炎癥反應因子檢測 采用ELISA法檢測檢測血清 IL-6、IL-8、CRP，所有操作均嚴格參照試劑盒(北京方程嘉鴻科技有限公司)的操作步驟，采用全自動酶標儀(DNM-9602G)檢測。實驗重復3次，取平均值。

1.4 血清脂代謝指標檢測 酶法檢測納入者血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)水平，直接法檢測低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)以及高密度脂蛋白(HDL-C)水平，采用全自動生化儀(日立7080)進行檢測。

1.5 ACI患者隨訪方法 采用門診、電子通訊等方式，對ACI患者進行為期1年的隨訪，采用格拉斯哥預后評分(GOS)評估ACI患者預后情況，GOS評分越高表示病情好轉，分數越低表示病情越重[8]。

2 結果

輕、 重度ACI患者及健康者血清循環miR-424相對表達量分別為0.71±0.21、0.62±0.24、0.98±0.36，與健康者比較，輕、 重度ACI患者血清循環miR-424相對表達量均降低(P均<0.05)；與輕度ACI患者比較，重度ACI患者血清循環miR-424相對表達量降低(P<0.05)。

輕、 重度ACI患者及健康者血清IL-6、IL-8、CRP水平比較見表1。

輕、 重度ACI患者及健康者血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較見表2。

輕度、 重度ACI患者GOS評分分別為(3.15±0.65)、(2.14±0.59)分，二者比較，P<0.05。相關性檢驗結果顯示，ACI患者血清循環miR-424水平與HDL-C、GOS評分呈正相關(r=0.49、0.61;P均<0.05)，與血清IL-6、IL-8、CRP、TC、TG、LDL-C水平均呈負相關(r=-0.36、-0.42、-0.39、-0.47、-0.56、-0.57;P均<0.05)。

表1 輕、 重度ACI患者及健康者血清IL-6、IL-8、CRP水平比較

注：與健康者比較，*P<0.05；與輕度ACI患者比較，#P<0.05。

表2 輕、重度ACI患者及健康者血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較

注：與健康者比較，*P<0.05。

3 討論

ACI是最常見的腦部疾病之一，病情復雜、預后差、致殘率高。近年ACI發病率逐年增加。ACI早期癥狀不明顯(如頭暈、嘔吐、頭痛等)，但病情發展迅速，可導致患者昏迷、半身不遂甚至死亡。尋找有效的ACI早期診斷、預后判斷的血清生物靶標有助于提高治療療效、改善患者預后。目前已發現多種與ACI關系緊密的血清分子，如ACI患者腦脊液中血清胱抑素C(cystatin C)可進入血循環，導致血清cystatin C水平升[9]；高尿酸血癥是心血管疾病的獨立危險因素，Han等[10]的回顧性研究結果證實，血尿酸與ACI患者的腦白質高信號有關[10]；此外，血清牙齦卟啉單胞菌特異性IgG是我國居民患ACI的危險因素[11]。

血清循環microRNAs能夠耐受RNA酶進而穩定存在于血循環，可作為疾病的診斷指標。Miyaaki等[12]研究發現，血清microRNA-122可作為非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)診斷的生物學標志分子。血清microRNA-218可作為食管癌患者早期診斷的生物標記物和雨后預測的靶分子[13]。卵巢癌患者血清microRNA-145[14]、乳腺癌患者血清microRNA-21[15]以及結腸癌患者血清microRNA-155[16]在診斷、預測病情進展及患者預后等方面均具有積極意義。血清miR-16可作為超急性腦梗死的診斷、危險評估及預后的生物靶標[17]；血清miR-24、miR-21可作為ACI患者早期診斷的生物靶標[4]；血清miR-124可作為腦梗死早期診斷的生物靶標[18]。

miR-424低表達與卵巢癌、非小細胞肺癌、乳腺癌和結腸癌的增殖、侵襲以及耐藥性均關系緊密[19～21]。miR-424在血管性疾病(如肺動脈高血壓)、中樞神經系統疾病(如脆性X相關的震顫/共濟失調綜合征)和不同組織干細胞分化中均發揮重要作用[22]。有研究[23]證實，小鼠腦缺血4 h后血清miR-424表達明顯降低，增加miR-424表達可減輕腦梗死體積和腦水腫。本研究發現，與健康者相比，ACI患者血清循環miR-424水平降低。說明miR-424減少可能參與并促進了ACI發生、進展。

高脂血癥、高血壓、炎癥反應、吸煙、酗酒等都是誘發ACI的重要危險因素。炎癥反應是導致ACI繼發性腦損傷的關鍵因素之一，Liu等[24]研究發現，ACI患者的血清IL-33水平顯著升高，可能參與并促進了ACI發生進展過程。本研究發現，ACI患者血清IL-6、IL-8、CRP水平均升高，提示炎癥反應因子參與了ACI發生、進展。近年來，越來越多的證據表明，炎癥在腦梗死發生和復發中發揮作用，如腦梗死患者血清中TNF-α、IL-1以及IL-6存在異常表達，炎癥反應強度可反映ACI病情嚴重程度，血清炎性因子是一系列對機體炎癥反應具有促進作用的細胞因子，在一定程度上可反應機體的應激狀態。

脂代謝紊亂與ACI關系密切，血脂升高可引起血液黏度升高，紅細胞攜氧和釋氧功能下降，導致局部組織缺血缺氧，易引發腦梗死。ACI患者普遍存在血脂代謝異常，多表現為TG、TC、LDL明顯升高，而HDL明顯降低[25]，本研究結果顯示，ACI患者血清TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，證實ACI患者體內存在脂代謝異常。

本研究進一步分析了血清循環miR-424與炎癥反應因子、脂代謝指標及GOS評分的相關性，結果顯示，ACI患者血清循環miR-424水平與血清IL-6、IL-8、CRP、TC、TG、LDL-C水平均呈負相關，與HDL-C呈正相關，提示ACI患者血清循環miR-424水平可反映患者炎癥反應、脂代謝的波動程度。盡管IL-6、IL-8、CRP、TC、TG、LDL-C、HDL-C均不是miR-424的直接靶基因，但各指標與miR-424均呈負相關性，由此推測，miR-424低表達可增加某些關鍵信號通路分子的表達，進而導致炎癥反應增強、脂代謝紊亂。miR-424是血管生成的重要調節因子，Lee等[26]發現miR-424參與炎癥介導的血管再生，后續研究將在體外細胞水平探究miR-424參與炎癥反應、脂代謝的分子機制。此外，本研究發現血清循環miR-424與ACI患者GOS評分呈正相關，GOS評分可反應患者功能預后情況，以上結果均提示，監測ACI患者血清循環miR-424水平，對病情評估、預后判斷有較高的臨床價值。

綜上所述，ACI患者血清循環miR-424表達下降，血清循環miR-424水平與ACI患者炎癥反應因子水平、脂代謝水平有關miR-424可能成為ACI患者預后評估的一種潛在的生物靶標。