氣相色譜-氫火焰離子化檢測器測定乳及乳制品中脂肪酸單甘油酯含量

文/戴洋洋 閆 磊 王春天 王紫竹 李 卉 宋 爽 曲建偉

（天津市乳品食品監(jiān)測中心）

脂肪酸單甘油酯（或甘油單脂肪酸酯），英文名為Monoglyceride（MG），產(chǎn)量最大、應(yīng)用最多的是硬脂酸單甘油酯。脂肪酸單甘油酯一般不溶于水，可與熱水?dāng)嚧虺筛酄钊橐海瑸槌Ｓ萌榛瘎榛軓姡哂休^大的適應(yīng)性，耐熱耐酸性好，適用于食品中乳化劑、分散劑、起泡劑、乳化穩(wěn)定劑。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織審定其可用作乳化劑，美國食品和藥物管理局毒性評價其為一般公認(rèn)安全。

一些生產(chǎn)廠家為了得到性狀較好的產(chǎn)品，向產(chǎn)品中添加乳化劑[1]。為了規(guī)范食品生產(chǎn)，最大程度地保護消費者的利益，產(chǎn)品質(zhì)量的監(jiān)督必須有相應(yīng)的技術(shù)作為支持。目前測定乳制品中脂肪酸單甘油酯的含量尚無相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，本文建立了相應(yīng)的方法，方法的準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性、檢出限等完全能滿足乳制品的要求。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

氨水（體積分?jǐn)?shù)≥25%）；乙醇（體積分?jǐn)?shù)≥95%）；乙醚；石油醚（沸程30～60 ℃）；吡啶（優(yōu)級純）；衍生化試劑：N，O-雙三甲基硅三氟乙酰胺（BSTFA）+三甲基氯硅烷（TMCS）（99+1）；鹽酸；正己烷-乙酸乙酯溶液（V/V=85∶15），使用前配制；二氯甲烷-甲醇溶液（V/V=2∶1），使用前配制；剛果紅溶液（1%，將1 g剛果紅溶于水中，稀釋至100 mL）；肉豆蔻酸單甘油酯、棕櫚酸單甘油酯、硬脂酸單甘油酯、油酸單甘油酯、亞油酸單甘油酯、山崳酸單甘油酯、月桂酸單甘油酯和亞麻酸單甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%）。

氨基固相萃取柱（填充物500 mg，容積6 mL）。

1.2 儀器和設(shè)備

氣相色譜儀（安捷倫7890A，帶氫火焰離子化檢測器），分析天平（0.0001 g）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取2.5 g（精確到0.1 mg）肉豆蔻酸單甘油酯、棕櫚酸單甘油酯、硬脂酸單甘油酯、油酸單甘油酯、亞油酸單甘油酯、山崳酸單甘油酯、月桂酸單甘油酯和亞麻酸單甘油酯標(biāo)品，置于50 mL容量瓶，用二氯甲烷定容至刻度，濃度為50.0 mg/mL左右，冰箱中冷藏保存。

1.4 測定步驟

1.4.1 試樣制備

稱取充分混勻的試樣（如巴氏殺菌乳、滅菌乳、生乳、發(fā)酵乳、調(diào)制乳）10 g（精確至0.1 mg）于毛氏抽脂瓶中，加入2.0 mL氨水，置于（65±5）℃的恒溫水浴鍋中[2]，加熱60 min，取出輕搖，冷卻至室溫。

1.4.2 脂肪提取

在試樣中加入10 mL乙醇，混勻，加入25 mL乙醚，加塞振蕩1 min，加入25 mL石油醚，加塞振蕩1 min，靜置分層，有機層轉(zhuǎn)入磨口圓底燒瓶中。隨后在試樣中加入5 mL乙醇，混勻，加入25 mL乙醚，加塞振蕩1 min，加入25 mL石油醚，加塞振蕩1 min，靜置分層，有機層合并至磨口圓底燒瓶中。再重復(fù)提取一次，合并所有提取液于磨口圓底燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于60℃恒溫水浴鍋中濃縮至干，將提取出的脂肪用二氯甲烷溶解，并定容至10 mL容量瓶中，待分離。

1.4.3 脂肪酸單甘油酯的分離

將氨基固相萃取柱用4 mL正己烷活化，取2 mL待分離的試液加入活化好的固相萃取柱中，用8 mL正己烷-乙酸乙酯溶液（V/V=85∶15）分4 次洗脫固相萃取柱，棄去，用6 mL二氯甲烷-甲醇溶液（V/V=2∶1）分3 次洗脫固相萃取柱，并將洗脫液收集在帶有螺口的試管中，50 ℃下氮氣吹干。

1.4.4 衍生化

向氮吹殘留物中加入200 μL吡啶和200 μL衍生化試劑，混勻，密封后置（70±1）℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，供氣相色譜測定。

1.5 儀器條件

色譜柱固定液為50%氰丙基和50%二甲基聚硅氧烷；30 m×0.25 mm，0.25 μm，或性能相當(dāng)者。載氣為氮氣（純度為99.999%）；載氣流速1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃；檢測器溫度300 ℃；分流比為30∶1；進樣量1μL；柱溫：初始溫度120℃，保持1 min，以10 ℃/min升至230 ℃，保持15 min。

1.6 結(jié)果計算

按照式1計算，其中：X為試樣中脂肪酸單甘油酯的含量，mg/kg；Ai為試樣中脂肪酸單甘油酯的峰面積；Cio為標(biāo)準(zhǔn)溶液中脂肪酸單甘油酯的濃度，mg/mL；D為樣液的稀釋倍數(shù)；V為樣液最終定容體積，mL；Aio為標(biāo)準(zhǔn)溶液中脂肪酸單甘油酯的峰面積；m為試樣的質(zhì)量，g。以重復(fù)性條件下獲得的獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留至三位有效數(shù)字。

2 試驗結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

準(zhǔn)確吸取各脂肪酸單甘油酯標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5、6 mL，分別置于100 mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL。分別取2 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液用氮氣吹干，按照1.4.4進行衍生化，氣相色譜測定。以各脂肪酸單甘油酯濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（表1）。

表1 各脂肪酸單甘油酯標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程及相關(guān)系數(shù)

2.2 脂肪酸單甘油酯的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

在既定色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)溶液中各脂肪酸單甘油酯的出峰時間隨著碳原子數(shù)和雙鍵數(shù)的增加而增加，出峰順序依次為月桂酸單甘油酯、肉豆蔻酸單甘油酯、棕櫚酸單甘油酯、硬脂酸單甘油酯、油酸單甘油酯、亞油酸單甘油酯，亞麻酸草甘油酯，山崳酸單甘油酯（圖1）。

表2 實際樣品測定結(jié)果

表3 添加回收試驗結(jié)果

表4 各脂肪酸單甘油酯的最低檢出限

圖1 脂肪酸單甘油酯的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

2.3 實際樣品測定

收集生鮮牛乳、酸牛乳、乳飲料3 類代表性樣品，按照測定步驟檢測了硬脂酸單甘油酯、棕櫚酸單甘油酯、肉豆蔻酸單甘油酯、月桂酸單甘油酯、山崳酸單甘油酯、亞油酸單甘油酯、亞麻酸單甘油酯和油酸單甘油酯的含量，每個樣品做12 個平行，測定結(jié)果見表2。

2.4 添加回收試驗

選擇生鮮牛乳、酸乳、乳飲料3 類代表性樣品，分別添加不同量的棕櫚酸單甘油酯、肉豆蔻酸單甘油酯、硬脂酸單甘油酯、月桂酸單甘油酯、山崳酸單甘油酯、亞油酸單甘油酯、亞麻酸單甘油酯和油酸單甘油酯，按提取方法和色譜條件測定添加回收量（扣除2.3測定的樣品本底值，以各脂肪酸單甘油酯含量計），每個樣品做6 個平行。從表3可以看出，本方法添加回收率為80%～120%，變異系數(shù)在允許范圍以內(nèi)，說明本方法有較好的準(zhǔn)確度。

2.5 檢出限

按照式2計算檢出限，其中b為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中的斜率，s為儀器噪音的3 倍，即儀器能辨認(rèn)的最小物質(zhì)信號，結(jié)果見表4。

3 結(jié)論

目前測定乳制品中脂肪酸單甘油酯的含量尚無相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，本文建立了相應(yīng)的方法，方法的準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性、檢出限等完全能滿足乳制品的要求。C