小麥 TaHTAS-5A基因的克隆、表達分析及亞細胞定位

劉 燕,趙 毅,呂 千,張 麗,李立群,李學軍

(西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院,陜西楊凌 712100)

植物在其生長發(fā)育過程中會不可避免的遭遇各種各樣的逆境脅迫，這使得植物必須發(fā)展有效的機制來適應(yīng)環(huán)境脅迫才能更好的生存繁殖[1]。在糧食作物中，小麥占據(jù)非常重要的地位，然而隨著全球氣候的不斷惡化，高溫、干旱、低溫和高鹽等非生物脅迫嚴重限制了小麥的生長發(fā)育和產(chǎn)量的提高[2-3]。因此，克隆關(guān)鍵的抗逆相關(guān)基因，研究其在非生物脅迫下的防御機制并利用基因工程手段培育多重抗性的小麥新品種具有重大意義[4]。近年來，越來越多的非生物脅迫調(diào)控基因被發(fā)現(xiàn),并且它們在脅迫響應(yīng)中的功能也已經(jīng)在擬南芥中得到了充分的驗證[5-6]；許多研究揭示，植物是通過重新調(diào)節(jié)代謝和基因表達來獲得對非生物脅迫的耐受性的[7-9]。研究表明，泛素化途徑可能影響植物對各種非生物脅迫的耐受性[10-12]，泛素26S蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)參與許多生物過程，包括細胞周期、信號轉(zhuǎn)導、DNA修復、蛋白質(zhì)運輸和逆境脅迫響應(yīng)等[13-17]。近年來，泛素系統(tǒng)中RING 型E3泛素連接酶基因參與非生物脅迫的研究越來越多，擬南芥C3H2C3型RING型E3泛素連接酶AtAIRP1是一個對干旱脅迫的脫落酸依賴性反應(yīng)的正調(diào)節(jié)因子[18]；水稻 OsDIS1基因編碼了一個C3HC4 Ring finger E3泛素連接酶，該基因在干旱脅迫中通過復雜的調(diào)控機制調(diào)節(jié)多種脅迫因子起到負調(diào)控作用[19]。在水稻中，泛素連接酶基因OsHTAS受高溫、低溫、鹽、ABA和過氧化氫的誘導，是一個多逆境響應(yīng)基因，并且在水稻苗期對高溫具有一定的耐受性[20]，但該基因在小麥中參與非生物脅迫的響應(yīng)機制還未見報道。因此，本研究利用同源克隆技術(shù)從小麥中分離 TaHTAS-5A基因，對其基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、進化關(guān)系、表達特性及亞細胞定位進行初步分析，并通過qRT-RCR技術(shù)分析該基因在小麥不同組織及不同非生物脅迫下的表達模式，以期為更加深入的研究 TaHTAS-5A基因的生物學功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為普通小麥品種中國春(Chinese Spring, CS)，用于基因的克隆和表達分析。缺體-四體材料N5AT5D、N5BT5A和N5DT5A，用于染色體定位。

1.2 方 法

1.2.1 材料處理

取CS的種子，先用70%的酒精和0.1%的次氯酸鈉依次進行表面消毒，再用無菌水沖洗3次，然后將種子均勻放置在含有兩層濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中，于25 ℃條件下進行水培(2 d更換一次水)，10 d后對小麥幼苗進行脅迫處理。干旱脅迫處理：將蒸餾水換成等量的20%的PEG-6000溶液；鹽脅迫處理：將蒸餾水換為等量的200 mmol·L-1的氯化鈉溶液；ABA脅迫處理：將蒸餾水換為100 μmol·L-1的ABA溶液；高溫脅迫處理：將待處理材料放入42 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；低溫脅迫處理：將待處理材料放入4 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別取脅迫處理0、3、6、9、12和24 h的葉片，迅速放進液氮冷凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

在田間小麥抽穗期，剪取其根、莖、葉和幼穗不同組織，將所有樣品均放入液氮中冷凍，在-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA提取及cDNA 第一鏈合成

使用Trizol試劑(華越洋，北京)提取小麥的不同組織及不同脅迫處理材料的總RNA，利用FastQuant RT Kit(with gDNase)(天根，北京)合成cDNA第一鏈，置于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3TaHTAS基因的克隆及染色體定位

根據(jù)水稻(Oryzasativa)OsHTAS[21]基因的登錄號(LOC_Os09g15430)在NCBI數(shù)據(jù)庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)中搜索其核苷酸序列，以水稻OsHTAS序列為探針，在小麥URGI基因組數(shù)據(jù)庫(https://urgi.versailles.inra.fr/blast/)進行blast，根據(jù)得到的小麥基因序列，利用Primer 5.0軟件在開放閱讀框外設(shè)計特異性PCR引物cF/R(表1)。

以CS的cDNA為模板，使用cF/R引物進行擴增， PCR體系與程序參考2×Taq MasterMix(康為世紀，中國)說明書，其中循環(huán)數(shù)為36，退火溫度為60 ℃，延伸時間為1 min 40s。擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將目的條帶回收純化，將純化產(chǎn)物連接至克隆載體 pEASY-T1(全式金，北京)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(天根，北京)，經(jīng)PCR鑒定的陽性克隆，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。根據(jù)小麥基因組數(shù)據(jù)庫(https://urgi.versailles.inra.fr/blast/)中AABBDD間核酸序列差異設(shè)計引物rF/R，利用中國春缺-四體材料進行染色體定位。

表1 本研究使用的引物信息Table 1 Primer information used in this study

1.2.4 小麥 TaHTAS-5A基因編碼蛋白的生物信息學分析

采用ExPASy-Protparam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)對TaHTAS-5A蛋白的基本理化性質(zhì)進行預測；應(yīng)用CBS-NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測目的蛋白磷酸化位點；用SOPMA(https://npsa- prabi.ibcp.fr/cgi- bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對TaHTAS-5A蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預測；通過SMART(http://smart.embl.heidelberg.del)對其保守結(jié)構(gòu)域進行分析；使用PSORT Prediction(http://psort.hgc.jp/form.html)對其進行亞細胞定位。將 TaHTAS-5A基因編碼蛋白序列提交到NCBI上進行Blast，獲得多個與 TaHTAS-5A同源的物種的氨基酸序列，然后用Clustal軟件對小麥TaHTAS-5A蛋白序列與水稻、大麥(Hordeumvulgare)、大豆(Glycinemax)、玉米(Zeamays)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、谷子(Setariaitalic)、粗山羊草(Aegilopstauschii)和高粱(Sorghumbicolor)等同源蛋白序列進行多序列比對分析，運用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 小麥 TaHTAS-5A的表達模式分析

根據(jù)測序所得 TaHTAS-5A序列，參照qRT-PCR引物設(shè)計原則設(shè)計目標基因特異性引物qF/R，以小麥18S RNA做內(nèi)參(表1)。用Faststart Essential DNA Green Master(2x)(Roche，德國)熒光染料進行基因表達分析，在Roche96 qRT-PCR擴增儀(Roche，德國)上進行qRT-PCR，試驗設(shè)計三個生物學重復和三個技術(shù)重復，擴增體系與程序參考Faststart Essential DNA Green Master(2x)說明書，其中循環(huán)數(shù)為45，退火溫度為63 ℃，基因相對表達量采用2-ΔΔCT方法[22]計算。

1.2.6 小麥TaHTAS-5A的亞細胞定位

設(shè)計帶有酶切位點(BSTE1酶切位點，下劃線標)的特異引物YF/R(表1)，將擴增得到的PCR產(chǎn)物連到經(jīng)相同內(nèi)切酶酶切的1302-2myc-EGFP載體(本實驗室保存)上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，將陽性克隆進行測序驗證，獲得融合載體1302-2myc-EGFP- TaHTAS-5A。采用注射煙草表皮細胞的方法，將表達載體導入煙草表皮細胞，并置于22 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30～36 h后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光蛋白在煙草表皮細胞的位置，未插入 TaHTAS-5A基因的1302-2myc-EGFP空載體作對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaHTAS-5A基因的克隆結(jié)果及序列分析

使用特異擴增引物cF/R以小麥CS的cDNA為模板，進行PCR擴增，在接近1 600 bp處得到一條與預期大小一致的目的條帶(圖1A)，將目的條帶進行回收、轉(zhuǎn)化，測序得到了三條不同的序列，將其翻譯為氨基酸與水稻OsHTAS氨基酸序列進行比對，選取與水稻序列同源性最高的一條序列進行后續(xù)試驗，該序列長度為1 588 bp，包括220 bp的5′UTR，126 bp的3′UTR以及1 242 bp的ORF。另外，將該序列編碼區(qū)翻譯得到的氨基酸序列提交至Phytozome 12數(shù)據(jù)庫中的Triticumaestivumv2.2(Common wheat)子數(shù)據(jù)庫中進行blast，發(fā)現(xiàn)該序列與位于小麥5AL染色體上ta_iwgsc_5al_v1_2691783的相似度高達99%，推測該基因應(yīng)為ta_iwgsc_5al_v1_2691783的等位變異基因。因此，初步把該基因命名為 TaHTAS-5A。將 TaHTAS-5A的cDNA與數(shù)據(jù)庫的iwgsc_5al的gDNA序列進行比對分析，明確該基因含有4個外顯子和3個內(nèi)含子，5A基因組全長3 819 bp(圖1B)。同時在小麥urgi數(shù)據(jù)庫中搜索到相應(yīng)的ta_iwgsc_5b與ta_iwgsc_5d序列。比對發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫5A基因組序列在1 406 bp處比5B和5D多出127 bp(圖2)。

2.2 TaHTAS-5A的染色體定位結(jié)果

根據(jù)數(shù)據(jù)庫中搜索到的5A、5B和5D序列之間的差異設(shè)計引物rF1/R1(表1)，在中國春缺體材料中擴增，在5A缺體中，擴不出339 bp的片段，而在5B缺體和5D缺體中卻可以擴增跟中國春一樣的兩條帶(圖3)，因此將該基因定位在5A染色體上，命名為 TaHTAS-5A，并把該序列提交到GenBank，登錄號為MF967573。

1： TaHTAS-5A 的PCR產(chǎn)物； M：DL2000 分子量標準。1:PCR products of TaHTAS-5A; M:DL2000 DNA marker.

圖1TaHTAS-5A的PCR擴增產(chǎn)物(A)及基因結(jié)構(gòu)示意圖(B)

Fig.1PCRproduct(A)andgenestructure(B)ofTaHTAS-5A

綠線標出的表示A比B、D多出的127 bp的序列。

The green line indicates a fragment of 127 bp in A greater than those in B and D.

圖2TaHTAS基因A、B和D間的序列差異

Fig.2SequencealignmentofTaHTASamongthreesubgenomes

M:DNA分子量標準DL600；1：中國春；2：水(陰性對照)；3：中國春5A缺體-5D四體(N5AT5D)；4：5B缺體-5A四體(N5BT5A)；5：5D缺體-5A四體(N5DT5A)。

M:DNA marker DL600; 1:Chinese Spring; 2:Water(Negative control); 3:Nullisomic 5A-tetrasomic 5D(N5AT5D);4:Nullisomic 5B-tetrasomic 5A(N5BT5A); 5:Nullisomic 5D-tetrasomic 5A(N5DT5A).

圖3TaHTAS-5A的染色體定位分析

Fig.3AnalysisofTaHTAS-5Achromosomemapping

2.3 TaHTAS-5A基因編碼蛋白的生物信息學分析

2.3.1 TaHTAS-5A基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

對 TaHTAS-5A基因編碼蛋白進行預測，結(jié)果表明，該蛋白理論分子量為45.62 kD，編碼413個氨基酸，其中絲氨酸(Ser)含量最高(10.4%)，甲硫氨酸(Met)含量最低(1.2%)，理論等電點為6.72，脂溶指數(shù)(Aliphatic index)為80.75。對TaHTAS-5A蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果表明，該蛋白主要含有α螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β轉(zhuǎn)角4種結(jié)構(gòu)，所占比例分別為23.49%、49.88%、21.31%和5.33%(圖4A)。蛋白磷酸化位點預測結(jié)果表明，TaHTAS-5A蛋白序列包含絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點，其中絲氨酸磷酸化位點最多，有36個。將TaHTAS-5A蛋白序列與水稻OsHTAS蛋白序列進行比對發(fā)現(xiàn)，兩者之間蛋白序列的相似度約為85%，應(yīng)為OsHTAS在小麥中的同源基因。對TaHTAS-5A蛋白保守域進行預測發(fā)現(xiàn)， TaHTAS-5A包含有一個與水稻OsHTAS蛋白相同的Ring finger保守結(jié)構(gòu)域(337-377位氨基酸殘基)(圖4B)。TMHMM Server 2.0預測結(jié)果表明，在N端存在4個跨膜區(qū)域，位置為88-110位氨基酸殘基、120-142位氨基酸殘基、206-224位氨基酸殘基和239-270位氨基酸殘基(圖4B)。

2.3.2 TaHTAS-5A基因編碼蛋白的系統(tǒng)進化分析

利用NCBI-BlastP進行比對分析得知，小麥的TaHTAS-5A蛋白與粗山羊草(Aegilopstauschii)、大麥(Hordeumvulgare)、玉米(Zeamays)、高粱(Sorghumbicolor)、谷子(Setariaitalic)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)以及水稻等物種的Ring finger結(jié)構(gòu)域高度同源，氨基酸序列同源性在85%～99%之間，其中與粗山羊草(XP_020181552.1)和大麥(BAK03789.1)的同源性最高為99%。進化分析表明(圖5)，普通小麥的TaHTAS-5A蛋白與粗山羊草(XP_020181552.1)、大麥(BAK03789.1)等植物處于同一分支，其中與粗山羊草的親緣關(guān)系最近；與高粱(XP_002462211.1)、二穗短柄草(XP_010238064.1)等植物處于另一分支，親緣關(guān)系較遠；與雙子葉植物大豆(XP_003543658.1)的親緣關(guān)系最遠。

2.4 TaHTAS-5A基因的表達模式分析

2.4.1 TaHTAS-5A基因在不同非生物脅迫下的表達分析

以提取的不同脅迫處理材料的cDNA作為模板，采用qRT-PCR技術(shù)對該基因在干旱、高鹽、ABA、低溫和高溫不同脅迫下葉片的表達水平進行分析。結(jié)果表明，在高溫處理下， TaHTAS-5A的表達量呈明顯下降的趨勢，在12 h時表達量達到最低(圖6A)。ABA處理后，該基因的表達情況與高溫處理下的表達趨勢類似(圖6B)。模擬干旱脅迫處理后，隨著脅迫時間的增加，該基因的表達量呈先下降后上升再下降的趨勢，但整體上基因的表達量變化幅度不大(圖6C)。在NaCl處理后，該基因表達量呈先上升后下降再上升的趨勢，處理12 h時達到最低(圖6D)。低溫處理后， 該基因的表達情況與NaCl處理后的表達趨勢類似，在脅迫處理3 h后表達量達到最高，之后表達量逐漸下降(圖6E)。由此可以看出，該基因受低溫強烈誘導。

以上結(jié)果表明， TaHTAS-5A基因的表達主要受低溫、高溫和ABA的影響，同時對干旱和鹽脅迫也有響應(yīng)，也就是說，基因受多種脅迫因子的誘導，可能涉及多種逆境脅迫信號轉(zhuǎn)導。

2.4.2 TaHTAS-5A基因的組織表達分析

組織特異性分析結(jié)果顯示， TaHTAS-5A在小麥的根、莖、葉和幼穗中都有表達，但在葉片和穗中的表達量明顯高于根和莖(圖6F)。表明該基因的表達有明顯的組織特異性，推測其可能在小麥葉片及幼穗生長發(fā)育和防御體系中發(fā)揮著重要的作用。

A：TaHTAS-5A蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析，藍線、紅線、綠線和紫線分別代表α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和隨機卷曲；B： TaHTAS-5A與OsHTAS氨基酸序列比對，紅色線條標出的為四個跨膜域，藍色線條標出的為Ring finger結(jié)構(gòu)域。

A：Analysis of the secondary structure of TaHTAS-5A protein. The blue，red, green and purple lines represent the alpha helix, extended strand, beta turn and random coil, respectively; B:The amino acid sequence alignment of TaHTAS-5A and OsHTAS; the red line mark for the four transmembrane domains, and the blue line mark Ring finger domain.

圖4小麥TaHTAS-5A蛋白結(jié)構(gòu)分析

Fig.4StructureanalysisofwheatTaHTAS-5Aprotein

圖5 小麥TaHTAS-5A蛋白的系統(tǒng)進化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of TaHTAS-5A

2.5 小麥TaHTAS-5A在煙草表皮細胞中的亞細胞定位分析

PSORT Prediction 的亞細胞定位預測結(jié)果顯示， TaHTAS-5A定位于細胞膜上的可能性最大。亞細胞定位結(jié)果顯示對照的1302-2myc-EGFP蛋白分布在煙草表皮細胞的細胞核和細胞膜部位(圖7A),而1302-2myc-EGFP-TaHTAS-5A融合蛋白只在細胞膜中表達(圖7B)，這說明該基因確實定位在細胞膜上，與預測結(jié)果一致，推測該基因的定位可能與其有4個跨膜域有關(guān)。

A：高溫(42 ℃ )；B:ABA(100 μmol·L-1);C:干旱(20%PEG6000);D:NaCl(200 mmol·L-1);E:低溫(4 ℃)；F:組織表達。

A：High temperature(42 ℃);B:ABA(100 μmol·L-1);C:Drought(20% PEG6000);D:NaCl(200 mmol·L-1);E:Low temperature(4 ℃)；F:Tissues expression.

圖6小麥TaHTAS-5A基因在不同非生物脅迫下和不同組織中的表達模式

Fig.6ExpressionpatternsofTaHTAS-5Ainwheatunderdifferentabioticstressesandindifferenttissues

3 討 論

本試驗采取同源克隆的方法從小麥品種中國春中成功克隆了 TaHTAS-5A基因，經(jīng)氨基酸序列比對及保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼了一個E3泛素連接酶典型的Ring finger保守結(jié)構(gòu)域，N端具有四個跨膜結(jié)構(gòu)域，這與前人在水稻上報道的OsHTAS蛋白N端包含4個跨膜結(jié)構(gòu)域、C端包含一個RING finger結(jié)構(gòu)域的研究結(jié)果相一致，OsHTAS是E3泛素鏈接酶，在泛素降解路徑中起著至關(guān)重要的作用[20]，所以根據(jù)其相似的結(jié)構(gòu)，推測 TaHTAS-5A也可能屬于一種泛素連接酶，參與逆境脅迫的調(diào)控。蛋白磷酸化是植物應(yīng)對脅迫環(huán)境，提高自我免疫和信號響應(yīng)的一種重要保護機制，蛋白的磷酸化/去磷酸化修飾也在信號傳遞過程中起到開關(guān)的作用，它可以調(diào)控生物個體對外界脅迫的響應(yīng)[23-24]。TaHTAS-5A蛋白序列具有多個磷酸化位點，由此推測該蛋白可能也會通過基因內(nèi)部的磷酸化參與小麥在逆境脅迫下生長應(yīng)答的信號轉(zhuǎn)導途徑[25]。

亞細胞定位結(jié)果表明， TaHTAS-5A基因主要是在細胞膜上表達，沒有特定的核定位功能。這可能與其蛋白含有4個跨膜結(jié)構(gòu)域有密切的關(guān)系，之前也有研究顯示，RING型鋅指蛋白經(jīng)常會含有的跨膜域可能與其參與的泛素降解途徑有關(guān)[26]， TaHTAS-5A蛋白也包含RING finger 結(jié)構(gòu)域與四個跨膜域。從而推測， TaHTAS-5A也可能參與泛素的降解途徑，從而參與小麥的非生物脅迫反應(yīng)的調(diào)控。

qRT-PCR結(jié)果表明， TaHTAS-5A基因?qū)Ω邷?、低溫、外源ABA有強烈響應(yīng)，干旱和鹽脅迫對其表達量的影響不明顯，但也有使其增長的趨勢，在高溫與外源ABA脅迫下，該基因表達量呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢，該基因受低溫強烈誘導呈現(xiàn)高表達趨勢，可見，該基因表達受多種脅迫影響，這與Liu[20]等在水稻中的研究結(jié)果相一致，由此表明 TaHTAS-5A可能涉及多種脅迫信號傳導，在信號轉(zhuǎn)導途徑中扮演了一個極其復雜的角色。在實際生產(chǎn)中，水稻苗期一般在炎熱的夏季，很容易遭受高溫脅迫，所以研究該基因在水稻苗期耐高溫具有重要意義。qRT-PCR的結(jié)果表明該基因?qū)Φ蜏?、高溫有強烈的響?yīng)，而小麥在苗期經(jīng)受越冬的過程，會遭受到低溫脅迫，灌漿后期也常會遇到高溫天氣，對于小麥而言，研究該基因?qū)γ缙诘蜏?、成熟期高溫脅迫的耐受性更有意義，所以本課題組后續(xù)會重點研究該基因在小麥低溫、高溫脅迫中的作用。

A：對照1302-2myc-EGFP空載定位；B：TaHTAS-5A蛋白定位。

A：The localization of control 1302-2myc-EGFP empty vector；B:The localization of TaHTAS-5A protein.

圖7小麥TaHTAS-5A基因在煙草表皮細胞中的亞細胞定位分析

Fig.7SubcellularlocalizationofwheatTaHTAS-5Ageneintobaccoepidermalcells