河南省小麥赤霉病菌對戊唑醇的敏感性

徐建強，張 勇，平忠良，孫 迪，劉鵬飛，楊 霞，李慧凱，曹 瑜 ，林曉民

(1.河南科技大學林學院，河南洛陽 471003; 2.安徽省農(nóng)科院植物保護與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，安徽合肥 230031)

由禾谷鐮孢菌復合群(Fusariumgraminearumspecies complex，F(xiàn)GSC)引起的小麥赤霉病，一直是中國江淮流域、西南冬麥區(qū)及東北春麥區(qū)最主要的小麥病害之一[1]。近年來，由于全球氣候變化和耕作制度的調(diào)整，赤霉病的發(fā)生在我國有北擴西移的趨勢，山東、河南、陜西等省麥區(qū)小麥赤霉病的流行頻率有所增加，發(fā)生程度加重[2]。赤霉菌不僅影響小麥產(chǎn)量，其在小麥中產(chǎn)生的鐮刀菌毒素還危害人畜健康[3-4]。目前，對小麥赤霉病的生物防治措施仍不完善，小麥品種赤霉病抗源匱乏，培育抗病品種困難重重[5-6]。小麥赤霉病的防治仍以化學防治為主，但是病菌已對防治赤霉病的主要藥劑—多菌靈產(chǎn)生了嚴重的抗藥性，且抗藥性群體有隨著種子調(diào)運及聯(lián)合收割機跨區(qū)作業(yè)等方式從抗藥性發(fā)生較早的江淮麥區(qū)北向山東、河南，西向湖北、四川擴散的趨勢[7-8]。

戊唑醇為三唑類殺菌劑，可引起小麥赤霉病菌菌絲形態(tài)和結(jié)構(gòu)的明顯畸形[9]。室內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)，戊唑醇處理后小麥赤霉病菌菌絲末端分枝增多，新生菌絲伸長受阻，菌絲體局部膨大，有時可見菌絲及芽管的消解[10]；此外，戊唑醇噴施可推遲麥穗上分生孢子的萌發(fā)，引起芽管畸形，不能形成侵染菌絲，嚴重影響病菌的侵染過程[11]。Yin等[12]、葉 滔等[13]及宋陽陽等[14]測定小麥赤霉病菌對戊唑醇敏感性的結(jié)果均顯示，戊唑醇對小麥赤霉病菌菌絲生長有很高的抑制作用。戊唑醇不但在溫室及田間對赤霉病有較好的防效，而且還能促進小麥增產(chǎn)[15]。目前，盡管已有河南省小麥赤霉病菌對戊唑醇敏感性的報道，但所用菌株僅為個別地區(qū)菌株，難以反映河南省的總體情況；而同一省份不同地市菌株對同一藥劑的敏感性存在著很大差異[16]。目前，尚未有河南省小麥赤霉病菌群體對戊唑醇敏感性的系統(tǒng)報道。為明確當前河南省小麥主產(chǎn)區(qū)赤霉病菌對戊唑醇的敏感性現(xiàn)狀，本研究采用菌絲生長速率法測定了2016年從河南省11個地市分離的小麥赤霉病菌對戊唑醇的敏感性，建立敏感基線，分析不同地區(qū)菌株的敏感性差異，以期為戊唑醇在河南省小麥赤霉病防治中的合理利用提供依據(jù)，為病原菌對藥劑的敏感性監(jiān)測提供信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2016年4-5月從河南省各地市大面積種植小麥的鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集染病麥穗，帶回實驗室后采用組織分離法，從小麥穗軸病健交界處分離赤霉病菌；如果麥穗上有粉紅色霉層或籽粒變癟，也可以從染病麥粒上直接分離；待長出生長一致的菌落后，轉(zhuǎn)入3%綠豆湯培養(yǎng)液里搖培，5 d后挑單孢，通過形態(tài)學鑒定共獲得小麥赤霉病菌單孢分離菌株 113株(表1)。

1.2 供試藥劑

98%戊唑醇(tebuconazole)原藥，廣西田園生化股份有限公司生產(chǎn)；97.9%的咯菌腈(fludioxonil)原藥，先正達(中國)投資有限公司生產(chǎn)；98%多菌靈(Carbendazim)原藥，山東省雙星農(nóng)藥廠生產(chǎn)。多菌靈原藥預溶于0.1 mol·L-1稀鹽酸中，戊唑醇和咯菌腈原藥預溶于甲醇中，均配制成1.0×104μg·mL-1的母液，放于4℃冰箱中備用。

表1 供試菌株采集信息Table 1 Tested isolates in the study

1.3 戊唑醇對小麥赤霉病菌的最低抑制濃度測定

隨機選取LYMJ-1、LYMJ-2、SQSY-1及LHLY-4四個菌株，進行戊唑醇對赤霉病菌最低抑制濃度(minimum inhibition concentration,MIC)測定，采用菌絲生長速率法進行[17]。將供試菌株在PSA平板上25 ℃培養(yǎng)3 d后，用打孔器在菌落邊緣制成直徑5 mm的菌餅，菌絲面朝下接入含0.5、1.0、2.0及4.0 μg·mL-1戊唑醇的PSA平板上，以不含藥劑的平板作對照[17]；每處理3次重復，于25℃下黑暗倒置培養(yǎng)3 d，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算各濃度藥劑的菌絲生長抑制率。以全部供試菌株菌絲生長受到抑制的最小濃度作為戊唑醇對小麥赤霉病菌的最低抑制濃度。

菌絲生長抑制率=(對照菌落直徑平均值-處理菌落直徑平均值)/(對照菌落直徑平均值-菌餅直徑)×100%

1.4 小麥赤霉病菌對戊唑醇的敏感性測定

試驗方法同1.3，戊唑醇濃度設置為0.031 25、0.062 5、0.125、0.250、0.50及1.0 μg·mL-1，培養(yǎng)3 d后計算各濃度下的菌絲生長抑制率，利用EXCEL 2007和DPS 6.55軟件插件中的“數(shù)量型數(shù)據(jù)機值分析”計算藥劑抑制菌絲生長的毒力回歸方程、相關系數(shù)R和有效中濃度(EC50)。

1.5 敏感性分布圖繪制及敏感性基線的確定

參照徐建強等[18]的方法，將病菌群體對供試藥劑的敏感性從低到高分成幾個區(qū)間，統(tǒng)計每個區(qū)間的菌株數(shù)和頻率，以每個區(qū)間的EC50中值為橫坐標，菌株頻率為縱坐標，制作病菌對戊唑醇的敏感性頻率分布圖。對所有EC50值利用DPS 6.55軟件進行Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗[16]。

1.6 不同地區(qū)菌株對戊唑醇敏感性差異的分析

采用最小顯著差異法(least significant difference,LSD)對戊唑醇對各縣市菌株的毒力進行單因素差異顯著性分析[16]；每地隨機選擇3株，共33株病菌(表1)，采用SPSS 20.0對戊唑醇抑制病菌菌絲生長的EC50值進行聚類分析[19]。

1.7 小麥赤霉病菌對戊唑醇和對多菌靈、咯菌腈敏感性的相關性分析

采用菌絲生長速率法[19]。從分離菌中選取對戊唑醇敏感性不同的菌株，測定其對咯菌腈的敏感性，濃度設置為0.006 25、0.012 5、0.025、0.05、0.10和0.20 μg·mL-1；測定其對多菌靈的敏感性，濃度設置為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.8 μg·mL-1。試驗及數(shù)據(jù)處理方法同1.3及1.4。參照李波濤等[20]的方法判斷病菌對戊唑醇和對多菌靈、咯菌睛敏感性的相關性。

2 結(jié)果與分析

2.1 戊唑醇對小麥赤霉病菌菌絲生長的MIC

由圖1可知，0.5 μg·mL-1戊唑醇對四株病菌的菌絲生長抑制率已在85%以上；隨著戊唑醇濃度的升高，菌絲生長抑制率逐漸增大；戊唑醇濃度達到4.0 μg·mL-1時，四個菌株則全部不生長。由此可知，戊唑醇對赤霉病菌菌絲生長的最低抑制濃度為4.0 μg·mL-1。不同菌株對戊唑醇的敏感性不同。

圖1 戊唑醇對小麥赤霉病菌菌絲生長的MICFig.1 MIC of tebuconazole to mycelial growth of Fusarium graminearum

2.2 小麥赤霉病菌對戊唑醇的敏感性及敏感基線

供試113株病菌對戊唑醇的敏感性基本呈連續(xù)性分布，EC50的變化范圍為0.010～0.237 μg·mL-1，最大值為最小值的24.19倍；平均EC50值為0.057±0.041 μg·mL-1(圖2A，表2)。Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗結(jié)果顯示，供試菌株對戊唑醇的敏感性頻率不符合正態(tài)分布(W=0.779，P<0.05)，但有 81.4% 的菌株(92株)集中位于圖2B中相應的主峰范圍內(nèi)，呈近似正態(tài)分布(W=0.974，P=0.067>0.05)，其敏感性頻率分布為連續(xù)單峰曲線，因此將其EC50平均值0.041±0.016 μg·mL-1作為小麥赤霉病菌對戊

唑醇的敏感性基線。

2.3 不同地區(qū)小麥赤霉病菌對戊唑醇的敏感性

由表2可知，同一縣市菌株對戊唑醇的敏感性差異較大，洛陽市洛龍區(qū)菌株差異最大，EC50最大值和最小值比達到14.40；其次為漯河臨潁，二者比值達到12.60；而鄭州鞏義菌株間敏感性差異最小(1.10)；其余大部分地區(qū)菌株EC50最大與最小比值為1.32～7.65。

除周口沈丘及洛陽孟津菌株外，其余9個縣市間菌株對戊唑醇的敏感性差異不顯著。戊唑醇的平均EC50值變化范圍為0.038～0.101 μg·mL-1，其中，洛陽孟津菌株最為敏感，而周口沈丘菌株最不敏感，兩地菌株EC50平均值比值為2.66。各地區(qū)菌株的平均EC50值比較，洛陽孟津、商丘睢陽、信陽平橋、駐馬店泌陽、鄭州鞏義五地菌株對戊唑醇的敏感性高于河南省平均水平；其他地區(qū)菌株對戊唑醇的敏感性低于河南省平均水平。

2.4 不同地區(qū)菌株對戊唑醇敏感性水平的系統(tǒng)聚類分析

根據(jù)33個小麥赤霉病菌菌株的EC50值，可將其分為5類(圖3)，所包括的菌株數(shù)分別為18、3、2、8及2個。除鄭州鞏義、洛陽孟津及商丘睢陽的菌株全部聚在第Ⅰ類外，其余縣市的菌株均出現(xiàn)在不同的類中，說明同一縣市的菌株對戊唑醇敏感性差異較大，而不同縣市菌株對戊唑醇敏感性差異不明顯，這與LSD法的分析結(jié)果一致，說明小麥赤霉病菌對戊唑醇的敏感性差異與菌株來源無明顯相關性。

圖2 小麥赤霉病菌對戊唑醇的敏感性(A)及頻率分布(B)Fig.2 Sensitivity(A) and frequency(B) of Fusarium graminearum to tebuconazole表2 河南省不同地區(qū)小麥赤霉病菌對戊唑醇的敏感性Table 2 Sensitivity of Fusaium graminearum to tebuconazole from different areas in Henan Province

采集地點Sampling siteEC50范圍Range/(μg·mL-1)EC50(Max.)/EC50(Min.)均值±標準差Mean±SD/(μg·mL-1)敏感性指數(shù)Toxicity index漯河臨潁 Linying County,Luohe0.010～0.12612.600.055±0.037abc0.96洛陽洛龍 Luolong District,Luoyang 0.015～0.21614.400.065±0.048ab1.14洛陽孟津 Mengjin County,Luoyang 0.031～0.0451.450.038±0.006c0.67南陽方城 Fangcheng County,Nanyang 0.034～0.0902.650.060±0.028abc1.05平頂山葉縣 Ye County,Pingdingshan 0.045～0.0791.760.059±0.015abc1.04商丘睢陽 Suiyang District,Shangqiu 0.037～0.0491.320.041±0.005bc0.72新鄉(xiāng)延津 Yanjin County,Xinxiang 0.041～0.0741.800.052±0.019abc0.91信陽平橋 Pingqiao District,Xinyang 0.020～0.0673.350.040±0.015bc0.70周口沈丘 Shenqiu County,Zhoukou 0.031～0.2377.650.101±0.068a1.77駐馬店泌陽 Biyang County,Zhumadian 0.013～0.0705.380.042±0.017bc0.74鄭州鞏義 Gongyi City,Zhengzhou 0.039～0.0431.100.041±0.002bc0.72總計 Total0.010～0.23723.700.057±0.041abc1.00

同列數(shù)據(jù)后不同字母表示在0.05水平差異顯著。

Different letters following data in same column indicate significant difference at 0.05 level.

圖3 不同地理來源菌株對戊唑醇敏感性水平的系統(tǒng)聚類分析Fig.3 Hierarchical cluster analysis on EC50 values of tebuconazole to Fusarium graminearum

2.5 小麥赤霉病菌的戊唑醇、咯菌腈、多菌靈敏感性相關性分析

戊唑醇對77株(隨機選取，對戊唑醇抗性不同)小麥赤霉病菌的EC50均值為0.059±0.041 μg·mL-1，咯菌腈對77株小麥赤霉病菌的EC50均值為0.010±0.011 μg·mL-1，二者的EC50值線性回歸方程為y=0.123x+0.003，b為正值，P<0.05，差異顯著；但決定系數(shù)(R2)為0.212，小于0.8，說明小麥赤霉病病菌對戊唑醇與咯菌腈的敏感性間無相關性。

戊唑醇對67株(隨機選取，對戊唑醇抗性不同)小麥赤霉病菌的EC50均值為0.066±0.046 μg·mL-1，多菌靈對67株小麥赤霉病菌的EC50均值為0.403±0.119 μg·mL-1，二者的EC50值線性回歸方程為y=-0.240x+0.418，b為負值，P<0.05，差異顯著；但決定系數(shù)(R2)為0.008，小于0.8，說明病菌對戊唑醇與多菌靈的敏感性間無相關性。

圖4 小麥赤霉病菌對戊唑醇與其對咯菌腈、多菌靈敏感性之間的相關性Fig.4 Correlation of the susceptibility of Fusarium graminearum between tebuconazole and fludioxonil,or carbendazim

3 討 論

Yin等[12]測定了40株禾谷鐮孢菌及116株亞洲鐮孢菌對戊唑醇的敏感性，基線分別為0.248和0.316 μg·mL-1。葉 滔等[13]測定了采自河南、山東、河北三省的120株病菌對戊唑醇的敏感性，建立的敏感性基線為0.103 μg·mL-1。宋陽陽等[14]測定了采自湖北省的100株病菌對戊唑醇的敏感性，敏感性基線為0.181 μg·mL-1。本研究中，小麥赤霉病菌對戊唑醇的敏感性基線為0.041 μg·mL-1，小于以上結(jié)果。這可能是由于菌株地理來源、供試菌株數(shù)目、用藥時間長短不同造成的。Yin等[12]所測得的敏感性基線值最高，這可能是由于其所用菌株多采自江蘇、浙江地區(qū)，小麥赤霉病在這些地區(qū)發(fā)生時間長，發(fā)病重，菌源數(shù)量大，用藥時間長，用藥水平較高，從而導致病菌對藥劑的敏感性有所降低。

葉 滔等[21]通過紫外誘變獲得了小麥赤霉病菌對戊唑醇的抗藥性菌株，表明病菌對戊唑醇可能具有抗性風險，但突變體獲得抗藥性的同時伴隨著生長繁殖能力的下降；戊唑醇與苯醚甲環(huán)唑、多菌靈、異菌脲、百菌清和福美雙均無交互抗性。本研究結(jié)果表明，小麥赤霉病菌對戊唑醇與其對多菌靈、咯菌腈的敏感性間無相關性。這為進行戊唑醇和其他藥劑的復配來對小麥赤霉病實施化學防治提供了參考。

當前河南省小麥赤霉病菌對戊唑醇的敏感性不符合正態(tài)分布，已出現(xiàn)了敏感性下降的亞群體，但菌株數(shù)量較少，所占頻率較低，這說明河南省小麥生產(chǎn)中仍然可使用戊唑醇進行小麥赤霉病的化學防治，也可以通過同其他藥劑復配來延緩抗性的發(fā)展。但為了追蹤病菌對藥劑的敏感性變化情況，生產(chǎn)中應持續(xù)監(jiān)測小麥赤霉病菌對戊唑醇的敏感性。