評估3種不同毒株的豬偽狂犬病活疫苗的免疫效果

林文耀，宋慶慶，劉玉梅，劉國民，黃 超

（金宇保靈生物藥品有限公司，內蒙古 呼和浩特 010030）

豬偽狂犬病（Pseudorabies,PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的以繁殖障礙、神經癥狀、呼吸道等為主要臨床癥狀的一種重要傳染病，嚴重影響養豬業的發展，早期由于疫苗的成功應用使得該病得到較好的防控。但自2011年以來豬偽狂犬病變異毒株的出現，給我國養豬業造成了較大的經濟損失。主要表現為豬群gE抗體陽性率顯著升高，發病妊娠母豬流產，產弱仔、死胎；新生仔豬死亡率高，同時出現角弓反張等神經癥狀，病死率在10%～50%。病毒的分離鑒定表明疫病由變異PRV毒株引起，并且新流行毒株處于獨立的進化分支，這對PR的防控提出了嚴峻挑戰[1-3]。目前，疫苗仍然是防控豬偽狂犬病的主要手段。但是由于保護性抗原的變異導致傳統的疫苗對新流行的毒株不能提供完全的保護[4-5]，而且中國獸藥信息網的獸藥基礎數據庫顯示不同生產廠家的豬偽狂犬病疫苗批簽發多達30多個，如何評估各個廠家不同毒株疫苗的免疫效果是養殖業迫切關心的問題。為了給豬場如何選擇高效的疫苗提供參考數據，本文選擇了市場占有率較高的3種不同毒株的豬偽狂犬病活疫苗，檢測豬偽狂犬病gE、gB、中和抗體效價，評估不同毒株疫苗的免疫效果。

1 材料與方法

1.1 試驗疫苗

選取3種不同毒株的活疫苗，分別為A疫苗（國內最新分離株C株，江蘇某公司生產，批號18251002），B 疫苗（HB2000株，湖北某公司生產，批號 171224），C 疫苗（Bartha-K61株，某進口產品，批號 L447795）。

1.2 試驗豬場

某豬偽狂犬病gE抗體陰性的一點式生產的豬場，豬偽狂犬病疫苗的免疫程序：出生滴鼻1頭份，70日齡肌注1頭份，100日齡加強免疫1頭份。試驗期為2018年2月8日至6月18日。

1.3 試驗設計

選取3棟產房依次編號為A、B、C。A產房的新生小豬滴鼻免疫A疫苗，做好耳號標記，如此類推。隨機挑選分別滴鼻免疫了A、B、C疫苗的70日齡健康仔豬各30頭（分別命名為A組、B組、C組），分別肌注A、B、C疫苗各1頭份，100日齡加強免疫1頭份。首次免疫前、二免前、二免后30d全組采血，分離血清，-20℃冷凍保存備用，分別進行豬偽狂犬病gE、gB、中和抗體檢測。

1.4 方法

1.4.1 gE、gB抗體檢測 采用海博萊公司生產的豬偽狂犬病病毒PRV-gE、PRV-gB抗體ELISA診斷試劑盒，檢測按照試劑盒說明書的標準流程進行。

1.4.2 中和抗體檢測 采集的試驗豬只血清分別使用經典的HB-J毒株和分離到的變異毒株CW毒株進行細胞中和試驗，檢測血清中和抗體滴度，評判免疫效果。具體操作方法按文獻進行[6]。使用GraphPadPrism6軟件對每組的平均中和抗體效價分析顯著性差異。

2 結果

2.1 3種不同毒株豬偽狂犬病活疫苗免疫后gE抗體檢測結果

A組、B組、C組的豬偽狂犬病病毒gE抗體陽性率均為0，說明試驗期間豬場沒有受到豬偽狂犬病野毒感染。

2.2 3種不同毒株豬偽狂犬病活疫苗免疫后gB抗體檢測結果

如表1所示，首免前A、B、C這3組gB抗體陽性率分別為66.67%、60.00%、60.00%，二免前、二免后30 d 3組的gB抗體陽性率均為100%，沒有顯著差異。

表1 3種不同毒株豬偽狂犬病活疫苗免疫后gB抗體檢測結果

2.3 3種不同毒株豬偽狂犬病活疫苗免疫后中和抗體的檢測結果

2.3.1 對比3種不同毒株豬偽狂犬病活疫苗免疫1次的平均中和抗體 如表2所示，A組疫苗在1次免疫30 d后對經典毒株HB-J和變異毒株CW都產生較高的中和抗體，高于B組、C組，差異顯著。

表2 3種不同毒株豬偽狂犬病活疫苗免疫1次的平均中和抗體

2.3.2 對比3種不同毒株豬偽狂犬病活疫苗免疫2次的平均中和抗體 如表3所示，與1次免疫比較，A組疫苗在2次免疫30 d后對經典毒株HB-J和變異毒株CW都產生較高的中和抗體，高于1次免疫后的滴度，差異顯著。B組、C組在2次免疫后中和抗體提升不明顯。

表3 3種不同毒株豬偽狂犬病活疫苗免疫2次的平均中和抗體

3 分析與討論

2011年以來，由于豬偽狂犬病病毒變異株的出現，我國多數地區相繼暴發PR疫情，PRV陰性的免疫豬群發病的案例時有發生，說明傳統的疫苗對新流行的變異毒株不能提供完全的保護。如何選擇高效的疫苗預防PR疫情的發生，是整個養豬業迫切關心的問題。

本研究通過對比3種不同毒株活疫苗的免疫效果，發現首次免疫和2次免疫后，雖然3種疫苗gB抗體陽性率都達到100%，但是中和抗體的水平差異顯著。總體而言，2次免疫后A疫苗對經典株和變異株都產生較高的中和抗體水平。B組、C組第2次加強免疫后產生的中和抗體水平與1次免疫差異不大，與我們實驗室的檢測結果相符：傳統疫苗免疫多次后中和抗體效價依然偏低（數據未發表）。值得注意的是A疫苗對變異株的中和能力高于經典株，與B疫苗和C疫苗結果相反，可能與A疫苗為最新分離毒株，和新流行毒株抗原位點更匹配有關。

中和抗體是B淋巴細胞產生的一種可溶性蛋白，能夠與病原微生物表面的抗原結合，使其失去感染力的抗體。偽狂犬病病毒的中和抗體有多種，包括gB抗體、gC抗體和gD抗體等。由于gB-ELISA試劑盒的方便使用，養豬業評估疫苗免疫效果往往只關注gB抗體的檢測。但gB抗體只是中和抗體的一部分。gC和gD抗體同時也發揮著重要的作用。gC抗體可以抑制病毒在靶細胞上的黏附作用，gD抗體具有抑制病毒穿入的作用，可以有效阻斷病毒的侵入[7-8]。而且gB抗體的檢測采用的是競爭ELISA的方法，只能定性，不能定量，無法明確知道抗體的滴度。如本研究結果，gB抗體陽性率都達到100%，這單一結果無法有效評估疫苗的優良。因此，建議養豬業在評估豬偽狂犬病疫苗免疫效果檢測gB抗體的同時，進行中和抗體的評估。可以通過中和試驗評估中和抗體效價，檢測血清的抗體中和病毒的中和效價，效價越高說明中和病毒的能力越強，可以有效提高感染的閾值，減少感染后的臨床癥狀以及損失，縮短排毒時間和減少排毒量。后續，我們會進行A疫苗對經典株和變異株的保護效力試驗，評估A疫苗與臨床攻毒保護的直接關系。本研究A疫苗2次免疫后產生的中和效價高于活疫苗+滅活疫苗+滅活疫苗的免疫組合方案產生的中和抗體，可能與疫苗毒株的免疫原性，疫苗的生產工藝和抗原含量，佐劑等有關系，提示A疫苗可以作為防控豬偽狂犬病的高效疫苗[9]，有效簡化現有“活+死”免疫組合方案，簡化豬場免疫程序，降低疫苗成本。