黑木耳復合多糖口服制劑對小鼠免疫功能的效應

張介馳 陳 鶴 孔祥輝, 陳靜宇

（1. 黑龍江省科學院微生物研究所，黑龍江 哈爾濱 150010；2. 黑龍江省科學院高技術研究院，黑龍江 哈爾濱 150001）

黑木耳（Auricularia auricular-judae）是一種既可食用又可入藥的膠質大型真菌，中醫認為，黑木耳性平、味甘，入胃、大腸經；具有滋補、潤燥、養血益胃、活血止血、潤肺、潤腸等作用。近年來，有關黑木耳的研究大都集中在多糖類。作為生物反應調節劑，黑木耳多糖增強免疫力及抑制腫瘤等功能已被大量研究證實[1-2]。本文以黑木耳多糖為主，輔以猴頭菇、姬松茸、香菇、灰樹花等多糖制成的復合多糖口服制劑[3]，研究其對小鼠細胞免疫及體液免疫功能的效應，進一步探明食藥用真菌多糖的藥用價值及其保健作用，為食藥用真菌多糖作為保健食品的開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

黑木耳多糖復合口服制劑由本實驗室自制；RPMI1640，Gibco公司；ConA，Sigma公司；MTT，Amresco公司；異丙醇，山東旭晨化工有限公司。

1.2 供試動物

選用上海西普爾-必凱實驗動物有限公司繁殖的 SPF級 CI/F1代健康磁性小鼠 200只，體重為19.0～21.9 g，實驗動物生產許可證號為SCXK（滬）2013-0016，合格證號：2008001672571。

1.3 主要儀器

T1000型電子天平，深圳市深合科技有限公司；SG-603生物安全柜，北京儀諾科興科技發展有限公司；多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；二氧化碳培養箱，山東博科生物產業有限公司。

1.4 試驗方法

（1）黑木耳復合多糖口服制劑制備方法。將黑木耳、猴頭菇、姬松茸、香菇、灰樹花清洗除雜，粉碎，按照配方量混合后，加入一定量的純化水加熱至沸騰，熱水浸提2次，每次2 h，合并濾液，用旋轉蒸發儀濃縮濾液，濃縮到一定程度加入調味劑進行調配，灌裝，滅菌，即得黑木耳多糖復合口服制劑。

（2）ConA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化試驗（MTT法）[4]。小鼠40只，隨機分成4組，即空白對照組及黑木耳復合多糖口服制劑高、中、低 3個劑量組。3個口服劑量分別為0.25 mL/(kg·bw·d)、0.50 mL/(kg·bw·d)、1.50 mL/(kg·bw·d)。經口每日一次給予小鼠相應劑量的受試物，空白對照組以無菌水代替，小鼠灌胃量為0.1 mL/10 g·bw，連續灌胃一月后，頸椎脫臼法處死小鼠，無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液的小平皿中，研磨脾臟，制成單個細胞懸液，經 200目篩網過濾，用 Hank’s液洗2次，每次離心10 min（1 000 r/min），然后將細胞懸浮于1 mLRPMI1640完全培養液中，臺酚蘭染色計數活細胞（均在 95%以上），用 RPMI1640完全培養液調整細胞濃度為 3×106個/mL。將細胞分兩孔加入24孔培養板中，每孔1 mL，一孔加75 μLConA 液（100 μg/mL），另一孔作為對照，置37 ℃、5%CO2培養箱中培養72 h，培養結束前4 h，每孔輕輕吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的 RPMI1640培養液，同時加入 MTT（5 mg/mL）50 μL/孔，繼續培養4 h，培養結束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解。將溶解液移入96孔培養板中，每孔做3個平行孔，用酶標儀在波長570 nm下測定各孔吸光度值。

淋巴細胞增殖能力=加ConA的光密度值-不加ConA的光密度值

（3）DNFB誘導小鼠遲發型變態反應（DTH）（耳腫脹法）[5]。小鼠40只，分組、劑量及給藥方法同1.4（2）實驗。連續灌胃一個月后，每只小鼠用剃毛機將腹部毛剃去，范圍約3×3（cm），用10 mg/mL DNFB溶液50 μL均勻涂抹致敏。5天后用10 mg/mL DNFB溶液10 μL均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進行攻擊，攻擊后24 h頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器取下直徑8 mm耳片，稱重。耳重差（mg）=右耳重-左耳重

（4）抗體生成細胞檢測(Jerne改良玻片法)[6]。小鼠 40只，分組、劑量及給藥方法同 1.4（2）實驗。連續灌胃一個月后，每只小鼠腹腔注射2%（v/v）的SRBC懸液0.2 mL進行免疫，4天后小鼠頸椎脫臼處死，取出脾臟，放在盛有適量無菌Hank’s液的小平皿中，研磨脾臟，制成單個細胞懸液，經 200目篩網過濾，用Hank’s液洗2次，每次離心10 min（1 000 r/min），最后將細胞懸浮于8 mLHank’s液中。將表層培養基加熱溶解后，放45 ℃水浴保溫，與等量pH 7.2～7.4兩倍濃度的Hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5 mL，再向管內加10%SRBC（v/v，用SA緩沖液配制）50 μL，25 μL脾細胞懸液，迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，做2個平行片，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入37 ℃、5%CO2培養箱中孵育1.5 h，然后將制備好的補體 1∶8稀釋后加入到玻片架凹槽內，繼續孵育1.5 h后，計數溶血空斑數。

溶血空斑數=溶血空斑計數×320

（5）血清溶血素測定（半數溶血值，HC50）[7]。小鼠 40只，分組、劑量及給藥方法同 1.4（2）實驗。連續灌胃一個月后，制備 2%（v/v）的 SRBC懸液，每只鼠腹腔注射0.2 mL進行免疫，4天后從小鼠眼底靜脈叢取血，于離心管內放置1 h，2 000 r/min離心10 min，分離并收集血清，血清200倍稀釋后，按檢驗方法測定樣品管及SRBC半數溶血時的光密度值。溶血素的量以半數溶血值（HC50）表示。

1.5 實驗數據統計

用SPSS軟件對各試驗原始數據進行方差齊性檢驗，滿足方差齊要求的數據資料，用單因素方差分析方法中的多個試驗組與一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計處理[8]；對非正態分布或方差不齊的數據資料用秩和檢驗進行統計處理[9]。

2 結果與分析

2.1 黑木耳復合多糖口服制劑對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化的效應

經口給予小鼠不同劑量的黑木耳復合多糖口服制劑一個月后，用MTT法進行ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化實驗，計算加 ConA孔與不加ConA孔吸光度值的差值，并對其進行方差齊性檢驗，滿足方差齊性要求，用單因素方差分析方法中的多個試驗組與一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計處理。由表 1結果可見，0.25 mL/(kg·bw·d)、0.50 mL/(kg·bw·d)、1.50 mL/(kg·bw·d)組小鼠脾淋巴細胞中加ConA孔與不加ConA孔吸光度的差值高于0 mL/(kg·bw·d)組，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 黑木耳復合多糖口服制劑對小鼠脾淋巴細胞轉化的影響（ ±s）

表1 黑木耳復合多糖口服制劑對小鼠脾淋巴細胞轉化的影響（ ±s）

注：同一列中試驗組與對照組相比，*表示差異顯著（P＜0.05），**表示差異極顯著（P＜0.01）。

[mL/(kg·bw·d)] 動物數/只 加ConA孔與不加ConA孔吸光度的差值劑量/0（對照） 10 0.136±0.082 0.25 10 0.326±0.021**0.50 10 0.261±0.092*1.50 10 0.348±0.067**

2.2 黑木耳復合多糖口服制劑對DNFB誘導小鼠DTH的影響

經口給予小鼠不同劑量的黑木耳復合多糖口服制劑一個月后，用耳腫脹法進行DNFB誘導小鼠DTH實驗，計算耳殼增重，并對其進行方差齊性檢驗，滿足方差齊性要求，用單因素方差分析方法中多個試驗組與一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計處理。由表 2結果可見，0.50 mL/(kg·bw·d)、1.50 mL/(kg·bw·d)組耳殼增重高于 0 mL/(kg·bw·d)組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 黑木耳復合多糖口服制劑對小鼠溶血空斑數的效應

經口給予小鼠不同劑量的黑木耳復合多糖口服制劑一個月后，用Jerne改良玻片法進行小鼠抗體生成細胞試驗，計算溶血空斑數，并對其進行方差齊性檢驗，不滿足方差齊性要求，用秩和檢驗進行統計處理。由表3結果可見，1.50 mL/(kg·bw·d)組小鼠溶血空斑數高于0 mL/(kg·bw·d)組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 黑木耳復合多糖口服制劑對DNFB誘導小鼠DTH的影響（ ±s）

表2 黑木耳復合多糖口服制劑對DNFB誘導小鼠DTH的影響（ ±s）

注：同一列中試驗組與對照組相比，*表示差異顯著（P＜0.05）。

劑量/[mL/(kg·bw·d)] 動物數/只 耳殼增重/mg 0（對照） 10 10.2±1.9 0.25 10 11.6±1.9 0.50 10 13.5±1.9*1.50 10 12.8±2.0*

表3 黑木耳復合多糖口服制劑對小鼠溶血空斑數的影響（ ±s）

表3 黑木耳復合多糖口服制劑對小鼠溶血空斑數的影響（ ±s）

注：同一列中試驗組與對照組相比，*表示差異顯著（P＜0.05）。

劑量/[mL/(kg·bw·d)] 動物數/只 溶血空斑數（103個/全脾細胞）0（對照） 10 12.4±2.1 0.25 10 13.5±2.4 0.50 10 14.6±3.8 1.50 10 17.8±2.7*

2.4 黑木耳復合多糖口服制劑對小鼠血清半數溶血值（HC50）的效應

經口給予小鼠不同劑量的黑木耳復合多糖口服制劑一個月后，用半數溶血值法測定小鼠的血清半數溶血值（HC50），并對其進行方差齊性檢驗，滿足方差齊性要求，用單因素方差分析方法中多個試驗組與一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計處理。由表4結果可見，0.25 mL/(kg·bw·d)、0.50 mL/(kg·bw·d)、1.50 mL/(kg·bw·d)組小鼠血清半數溶血值（HC50）高于 0 mL/(kg·bw·d)組，差異有統計學意義（P＜0.01）。

3 結 論

3.1 細胞免疫功能

ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化試驗中，0.25 mL/(kg·bw·d)、0.50 mL/(kg·bw·d)、1.50 mL/(kg·bw·d)組小鼠脾淋巴細胞中加ConA孔與不加ConA孔吸光度的差值顯著或極顯著高于0 mL/(kg·bw·d)組；DNFB 誘導小鼠 DDTH 試驗中，0.50 mL/(kg·bw·d)、1.50 mL/(kg·bw·d)組 耳 殼 增 重 顯 著 高 于 0 mL/(kg·bw·d)組。

表4 黑木耳復合多糖口服制劑對小鼠HC50的影響（ ±s）

表4 黑木耳復合多糖口服制劑對小鼠HC50的影響（ ±s）

注：同一列中試驗組與對照組相比，**表示差異極顯著（P＜0.01）。

劑量/[mL/(kg·bw·d)] 動物數/只 HC50 0（對照） 10 135±3 0.25 10 143±4**0.50 10 142±4**1.50 10 147±7**

3.2 體液免疫功能

抗體生成細胞檢測試驗中，1.50 mL/(kg·bw·d)組小鼠溶血空斑數顯著高于0 mL/(kg·bw·d)組；小鼠血清半數溶血值試驗中，0.25 mL/(kg·bw·d)、0.50 mL/(kg·bw·d)、1.50 mL/(kg·bw·d)組小鼠血清半數溶血值（HC50）極顯著高于0 mL/(kg·bw·d)組。

綜上結果，黑木耳復合多糖口服制劑在提高細胞免疫和體液免疫方面都具有積極作用（正效應），差異有統計學意義。表明黑木耳復合多糖口服制劑具增強免疫力的保健功能，有藥用價值。