芍藥苷對大鼠術后腸粘連影響及其作用機制探討

常 琦 劉 濤 張 磊 高 琪

術后腸粘連是腹腔手術后最為常見的并發癥，發生率約93%[1]。腸粘連最常見的并發癥是腸梗阻，其次會引起育齡婦女不育。目前預防術后腸粘連形成的藥物或材料較多，如各種形式的膜類材料、粘性膠和腹膜內溶液類及中藥制劑等。但是能有效地預防術后腸粘連形成的材料仍然缺乏[2]。研究[3]顯示,芍藥苷可通過降低炎癥反應而減輕關節炎，故本研究通過構建腸粘連模型，評估粘連形成結局，檢測術后的轉化因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白介素-8(interleukin 8，IL-8)的表達量，明確芍藥苷是否可通過降低炎癥反應減輕術后粘連形成，為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 選取健康雄性大鼠40只，3周齡，體質量為(130.00±10.00)g(購于延安大學實驗動物中心)；TGF-β、IL-8 ELISA試劑盒購自武漢建成生物科技公司；TGF-β、IL-8抗體購自Sigma公司購買；明質酸鈉鹽購自上海華源生命科學研究開發有限公司；芍藥苷購自上海麥克林生物科技公司；其余實驗器材均共享自延安大學基礎實驗室。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 采用電腦編號隨機抽取大鼠，分為空白對照(Sham)組、對照組(Control)組、透明質酸鈉鹽(Hyaluronate)陽性對照組(HA組)以及芍藥苷組(Paeoniflorin)4個組；每組大鼠為10只。

1.2.2 造模及給藥 術前3天將4組動物放入飼養室中，使動物習慣飼養環境，手術前晚禁食不禁水；采用戊巴比妥麻醉，麻醉劑量為40 mg/kg，麻醉后所有動物剃毛消毒，無菌下進行手術。Sham組正常開腹后找到盲腸向外拉出然后放回；其余3組均參照李培寧教授[4]的盲腸摩擦+對應腹壁損傷模型進行腸粘連造模，即進行盲腸無菌濕紗布摩擦，均勻摩擦致漿膜破損出現微小出血點；對應腹壁使用手術刀片刮損直至壁層腹膜破損。HA組完成造模后于摩擦面給予HA 10 mg(濃度為10 mg/mL)。造模完成后逐層關閉腹腔。芍藥苷組造模完成后麻醉清醒即通過灌胃給予60 mg/(kg·d)芍藥苷。芍藥苷的給藥劑量與方式, 參照文獻[5-6]并結合芍藥苷毒理學劑量。

1.3 觀察指標 構建大鼠模型后第10天二次剖腹，按照Evans[5]的標準對各組粘連進行分級后并評分；通過病理分析各組炎癥滲出情況；比較各組GF-β、IL-8的表達水平。

1.3.1 粘連評分及標本采集 術后第10天，采取U型開腹，觀察粘連形成情況。由2位非直接參與實驗人員參照文獻[5]對粘連進行分級后并評分。0分:無粘連;1分:1 ～ 2處輕微粘連, 輕拉即開;2 分:2處以上粘連, 尚能分離,分離后不留痕跡;3分:多處粘連, 較難分離或粘連雖不多, 但不能分離;4 分:粘連成團, 不能分離。評分完畢后進行粘連標本采集，將標本直接放入-80℃冰箱保存備用；取腹主動脈血用于檢測細胞因子。

1.3.2 病理學分析炎癥滲出 常規石蠟切片HE染色,光鏡觀察粘連組織中炎癥細胞等病理參數的變化情況；每只大鼠粘連組織切5張切片，隨機選取2張切片，其中每張切片隨機選取3個高倍視野(20×10)進行評分，參照Saber法[6]對每只大鼠切片進行評分。炎癥評分：1分，無炎癥反應細胞；2分，鏡下可見巨核細胞、淋巴細胞和漿細胞；3分，鏡下可見巨核細胞、漿細胞、嗜酸性細胞和中性粒細胞；4分，鏡下可見炎癥細胞浸潤和微小膿腫形成。纖維形成評分：0分，無纖維形成；1分，輕度纖維形成；2分，中度纖維形成；3分嚴重纖維形成。

1.3.3. TGF-β、IL-8的表達 采用蛋白質印跡(Western blot)定量分析TGF-β、IL-8的表達。取粘連組織40 mg充分研磨，RIPA裂解后常規使用BCA法蛋白定量。根據蛋白標準曲線統一上樣量為40 μg，其他凝膠配置及溶液配置均參照試劑盒說明書。設置電壓濃縮膠：75 V 30 min；分離膠恒壓110 V 1.5 h；一抗TGF-β濃度為1∶800、IL-8濃度為1∶500；最后進行Image Lab(美國)發光、圖像采集及數據處理。

2 結果

2.1 4組大鼠術后腸粘連的分級及評分比較 術后第10天，肉眼觀察Control組大鼠有大量的腸粘連出現，創面與小腸、腹壁間粘連廣泛，粘連組織致密，難以分開；Sham組中傷口周圍有部分腸粘連，無其他粘連；HA與Paeoniflorin(芍藥苷)組腸粘連顯著減少，而Paeoniflorin組腸粘連較HA組較少(見圖1)。Control組大鼠粘連等級都在3～4級，平均評分為(3.43±0.35)分；Sham組粘連等級在1～2級，平均評分為(1.33±0.41)分；HA組中粘連等級在2～3之間，評分為(2.13±0.61)分；芍藥苷組中粘連等級為1～2級，平均評分為(1.81±0.44)分,與Control組比較,差異有統計學意義(P<0.05)，詳見圖2。

圖1 術后各組大鼠腸粘連情況對比

圖2 術后各組粘連的評分

注：A為術后粘連等級圖；B為術后粘連評分圖；*本組與Control組比較差異有統計學意義(P<0.05)

2.2 4組大鼠炎癥滲出比較 通過病理分析各組大鼠炎癥滲出，結果顯示Control組粘連組織中有大量的炎癥細胞滲出，有新生的毛細血管產生；在Sham組中無炎癥細胞滲出；在HA組中炎癥細胞中等滲出；Paeoniflorin組中炎癥較Control組顯著降低，并且優于HA組，詳見圖3、4。

2.3 TGF-β、IL-8的表達水平及定量分析 采用ELISA檢測TGF-β、IL-8的表達，結果顯示Paeoniflorin組中TGF-β、IL-8的表達水平明顯降低，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05),詳見圖5。采用Western blot定量分析TGF-β、IL-8水平，結果顯示在Paeoniflorin組中TGF-β、IL-8的表達水平降低，與血中TGF-β、IL-8的表達結果一致，詳見圖6。

圖3 術后各組炎癥病理(HE×200)

圖4 術后各組HE染色炎癥評分

注： *表示與對照比較，差異有統計學意義(P<0.05)

圖5 ELISA分析術后炎癥因子TGF-β與IL-8

注：A為術后各組GTF-β含量的變化；B為術后各組IL-8含量變化。*與對照比較，差異有統計學意義(P<0.05)

圖6 Western blotting定量分析炎癥因子TGF-β與IL-8

3 討論

腹膜間皮細胞受損后其修復是一個復雜的過程。當敏感的間皮細胞受到打擊或局部手術創傷后則有一系列血管反應事件隨之而來，最終導致炎癥和組織修復[7]。在創傷愈合中炎癥細胞因子在纖維蛋白沉積和降解的平衡中是至關重要的。炎癥細胞因子的總體作用是改變纖維蛋白沉積和降解的平衡，并有利于纖維形成，其中TGF-β以及IL-8在此過程中發揮重要的作用。

TGF-β是一種強效的細胞因子，具有調節、啟動以及終止組織修復的作用[8-9]。在粘連的形成中，無論是在動物模型還是體外實驗，TGF-β是目前研究較為明確的炎癥細胞因子之一。研究[10-11]顯示，在動物模型中,術后創面使用重組TGF-β試劑后，粘連顯著增加；使用TGF-β抑制劑后粘連顯著降低。手術創傷后TGF-β受體在腹膜組織以及腹膜積液中顯著升高。TGF-β過度表達可直接致組織纖維化，促進纖維粘連的轉化[8]。因此，可能會降低早期纖維素滲出的溶解能力，最終導致纖維堆積及膠原沉積促進粘連形成。由此可見，TGF-β是主要的纖維蛋白溶解抑制劑以及纖溶酶原激活物抑制劑。因此，通過抑制TGF-β表達則可促進纖維溶解，降低膠原沉積，最終減輕腸粘連的形成。

IL-8由腹膜間皮分泌，是炎癥細胞高度選擇性趨化因子[12]，可以激活嗜中性粒細胞脫粒。受損的間皮細胞分泌IL-8后促進炎癥細胞的進一步聚集[13]。間皮細胞分泌IL-8后可刺激TNF- α和IL-1的分泌，升高的TNF- α具有較強的抑制腹膜纖溶活性。與無胃腸道穿孔的患者相比，有穿孔患者其腹腔液中IL-8濃度在手術時增加100倍[14-15]。IL-8在術后粘連形成的作用的具體機制仍不清楚，可能是通過升高TNF- α及炎癥滲出促進纖維形成最終導致粘連形成。

此外，中醫藥的理論在調理術后機體胃腸道功能及抑制術后腹腔粘連方面具有確切的療效,越來越多的理念被引入術后康復中[16]。芍藥同時具有活血祛瘀作用,可改善腸壁循環,促進腸壁水腫消退和粘連吸收, 增強腸蠕動，從而減少創面間的接觸時間，降低了創面間的纖維沉積。

本實驗顯示，芍藥苷顯著降低了TGF-β、IL-8表達水平，使用芍藥苷后粘連組織炎癥滲出、粘連程度明顯低于模型對照組, 說明芍藥苷對TGF-β、IL-8的表達具有抑制效果，具有良好的抗炎效應，從而減輕術后粘連的形成。TGF-β、IL-8的高表達與纖溶抑制以及纖維形成緊密相關，本研究顯示，術后使用芍藥苷粘連形成明顯減少，實驗組大鼠術后粘連組織中的TGF-β、IL-8表達量均顯著低于對照組(P<0.05)。表明芍藥苷預防大鼠術后腸粘連的作用機制可能是抑制TGF-β、IL-8的過度表達、降低纖維蛋白的形成、促進纖溶活性、減少膠原沉積，最終發揮減輕術后腸粘連的作用效果。

綜上所述，術后使用芍藥苷可能通過降低炎癥反應與纖維形成致膠原過度沉積，進而減輕術后腹腔粘連的形成，芍藥苷將有望成為預防腹腔粘連的新方向。