不同種質資源五味子藤莖中4種木脂素的含量及品質評價

金銀萍，艾軍，夏娟，郭靖，樸向民，王英平

（中國農業科學院特產研究所，長春 130112）

五味子為五味子科植物五味子（Schisandra chinensis）的干燥成熟果實，具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效[1]。五味子果實藥效顯著，營養價值高。目前，五味子除藥用外，在食品、飲料、酒、保健品等行業都被廣泛運用，市場需求量逐年增加，五味子的種植面積不斷擴大。人工栽培條件下，五味子冬季和夏季修剪是獲得高產穩產和優質必不可少的技術環節。據不完全統計，在五味子的1個生長周期中，僅被修剪丟棄的藤莖、葉量與果實產量相當，如何利用莖、葉資源，對擴大五味子資源利用范圍，增加農民收入，保障五味子產業的快速健康發展具有重要意義。

研究結果表明，五味子藤莖中含有與果實類似的化學成分，4年生以上莖藤中五味子甲素、五味子乙素含量均高于果實[2～4]。藥理實驗也表明，五味子藤莖、葉的提取物具有護肝、抗菌、抗氧化等多種功效[5～7]。本試驗共收集了19種五味子優秀品系，其中包括鑒定的新品種“嫣紅”，考察不同種質資源五味子藤莖中4種木脂素的含量變化，并采用聚類分析法對其品質進行評價，為五味子藥材的綜合開發利用以及新品種的選育提供理論參考。

1 材料

1.1 試驗材料

19種不同五味子種質資源，于2017年3月10日～3月12日采自通化國家農業科技產業園五味子優良種苗示范推廣基地，經艾軍研究員鑒定為五味子科植物五味子〔Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.〕的藤莖。

1.2 儀器與試劑

ACQUITY超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；CPA225D 電子天平（德國 Sartorius公司）；KQ-500DE型數控超聲波清洗器（功率：500W；工作頻率：40kHz，昆山市超聲儀器有限公司）；N-1100旋轉蒸發儀（日本東京理化有限公司）。

五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素對照品（批號分別為：110857、110764、110765）（中國食品藥品檢定研究所）；五味子醇乙（批號：YY90208，上海源葉生物科技有限公司）；乙腈（色譜純）（美國Fisher公司）；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1mm 50mm，流動相：乙腈（A）-水（B）；梯度洗脫程序：0min～1min、48%～50%A，1min～3min 、50%～70%A；3min～4.5min 、70%～95%A，4.5min～6.5min 、95%A，6.5min～7.0 min、95%～48%A，7min～9min 、48%A；柱溫：35℃；樣品溫度：15℃；檢測波長：254nm；流速：0.35 mL/min；進樣量：1.0；理論板數（N）：五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的N均＞5 000。而且，各成分基線分離良好，分離度＞1.5（見圖1）。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 UPLC chromatogram

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素對照品適量，置于10mL容量瓶中，甲醇超聲溶解定容至刻度，搖勻，得質量濃度分別為115.0/mL、64.0/mL、66.0/mL、47.0mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取五味子藤莖藥材粉末（過4號篩）2.0g，用濾紙包好，置于100mL具塞錐形瓶中，精密加入50mL甲醇，超聲提取3次，每次30min，濾過，合并濾液，減壓濃縮至干，加入適量蒸餾水溶解，用石油醚萃取，棄去萃取液，將水層減壓濃縮至干，甲醇定容至25mL棕色容量瓶內，搖勻，即得。

2.3 線性關系考察

分別精密吸取混合對照品儲備液適量，稀釋配制成系列濃度梯度的對照品溶液。按照“2.1”項下色譜條件進行測定。以色譜峰峰面積為縱坐標Y、對照品濃度為橫坐標X（μg/mL）繪制標準曲線。結果表明，五味子醇甲回歸方程為Y=11 600X+16 900（R2=0.999 9），11.5μg/mL～115.0μg/mL 范圍內線性關系良好；五味子醇乙回歸方程為Y=9 150X+7 080（R2=0.999 9），6.6μg/mL～66.0μg/mL范圍內線性關系良好；五味子甲素回歸方程為Y=11 500X+6 810（R2=0.999 9），4.7μg/mL～47.0μg/mL范圍內線性關系良好；五味子乙素回歸方程為 Y=8 470X+4 870（R2=0.999 8），6.4μg/mL～64.0μg/mL范圍內線性關系良好。

2.4 精密度試驗

取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續進樣6次，進樣量1.0μL，測定峰面積，計算得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的峰面積RSD分別為0.43%、0.57%、0.83%和0.66%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗

取同一五味子藤莖供試品溶液，室溫下放置，分別于 0h、2h、4h、6h、8h、10 h 按“2.1”項下色譜條件進行測定。五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的峰面積RSD分別為1.26%、1.43%、1.74%和1.61%，表明供試品溶液在10 h內穩定性較好。

2.6 重復性試驗

分別精密稱取同一五味子藤莖樣品 6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進行測定。五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的峰面積RSD分別為1.27%、1.96%、2.38%、和2.08%，表明本方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的五味子藤莖樣品6份，加入混合對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備加樣供試品溶液。各成分的加樣回收率和RSD分別為五味子醇甲102.22%和1.87%、五味子醇乙98.02%和2.36%、五味子甲素97.67%和2.93%、五味子乙素97.44%和2.85%。

2.8 藥材樣品含量測定

按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定樣品。結果表明，不同種質資源五味子藤莖中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的含量與木脂素合計的變化趨于一致。不同種質資源間五味子藤莖的木脂素類含量存在較大差異，其中五味子醇甲最高達0.752mg/g，最低為0.118mg/g，其他3種木脂素類似。以木脂素的總量為評價指標，品系白果最佳，品系130-9-6次之。見表1。

表1 不同種質資源五味子藤莖中4種木脂素的含量Table 1 Contents of four lignans in the stems of from different germplasm resources（n=3，mg/g）

續表1

2.9 聚類分析

以五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素4種活性成分為指標，采用DPS 12.01統計軟件對19種不同種質資源的五味子藤莖藥材進行系統聚類分析。距離采用歐式距離，聚類方法采用最短距離法。結果顯示，19個樣本共分為5類，其中130-9-6和白果2個樣品聚為第1類，99-8-7聚為第2類，158-11-6聚為第3類，18-10-3聚為第4類，其余14種聚為第5類。見圖2。

從表1和圖2可知，質量較好的樣本聚成了第1類，品系130-9-6和白果均聚在了這一類中，此類中木脂素含量較高，由此可以判斷出這兩個品系的五味子藤莖質量較好。

圖2 聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram of cluster analysis

3 討論

選擇藥效成分木脂素含量高的優良品系對于五味子藤莖的品質評價起著至關重要的作用。本試驗收集19種不同優良品系的五味子，應用UPLC同時測定了五味子藤莖中4種主要的藥效木脂素類成分的含量，并通過聚類分析方法，以期優選出最佳的五味子品系。試驗結果表明，五味子藤莖中含有與果實相同的木脂素成分，且不同種質資源間五味子藤莖的木脂素的含量差異顯著；聚類分析結果表明，五味子藤莖品系白果和130-9-6的品質較好，含木脂素藥效成分含量較高。